hírek

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A rákos sejtek különféle mechanizmusokat fejlesztettek ki a sejtek stresszének leküzdésére, és tovább fejlődnek.A protein kináz R (PKR) és protein aktivátora (PACT) a kezdeti válaszadók, amelyek figyelik a különböző stresszjeleket, amelyek a sejtproliferáció és az apoptózis gátlásához vezetnek.A PACT-PKR útvonal szabályozása azonban a rákos sejtekben továbbra is nagyrészt ismeretlen.Itt azt találtuk, hogy a hosszú, nem kódoló RNS (lncRNS) aszpartil-tRNS szintetáz antiszensz RNS 1 (DARS-AS1) közvetlenül részt vesz a PACT-PKR útvonal gátlásában, és elősegíti a rákos sejtek proliferációját.A CRISPRi 971 rákkal kapcsolatos lncRNS nagyszabású funkcionális szűrésével azt találtuk, hogy a DARS-AS1 szignifikánsan megnövekedett rákos sejtproliferációval jár.Ezért a DARS-AS1 knockout gátolja a sejtproliferációt és elősegíti a rákos sejtek apoptózisát különböző rákos sejtvonalakban in vitro, és jelentősen csökkenti a tumor növekedését in vivo.Mechanikailag a DARS-AS1 közvetlenül kötődik a PACT aktivációs doménhez, és megakadályozza a PACT-PKR kölcsönhatást, ezáltal csökkenti a PKR aktivációt, az eIF2α foszforilációt és gátolja az apoptotikus sejthalált.Klinikailag a DARS-AS1 széles körben expresszálódik többszörös rákban, és ennek az lncRNS-nek a túlzott expressziója rossz prognózist jelez.Ez a tanulmány megvilágítja a PACT-PKR útvonal rákspecifikus szabályozását a DARS-AS1 lncRNS-sel, és egy másik célpontot biztosít a rák prognózisához és kezeléséhez.
A stresszhez való alkalmazkodás képessége fontos jellemzője a rákos sejtek túlélésének és szaporodásának.A rák gyors proliferációja és metabolikus jellemzői zord mikrokörnyezetben csúcsosodnak ki – tápanyaghiány, hipoxia és alacsony pH-érték –, amelyek sejthalál jelátviteli útvonalakat indíthatnak el.A stressz-érzékeny gének, például a p535, a hősokk fehérjék 6, 7, KRAS8, 9 és HIF-110, 11, 12, 13 szabályozási zavara gyakran megfigyelhető rákban, ami blokkolja az apoptózist és elősegíti a túlélést.
A proteinkináz R (PKR) az eukarióta 2α iniciációs faktor (eIF2α) fontos stresszérzékelője és alegység-kináza, egy transzlációs szabályozó, amely a sejtstresszt a sejthalálhoz köti.A PKR-t eredetileg vírusellenes fehérjeként azonosították egy idegen kettős szálú RNS (dsRNS) kimutatásával.Aktiváláskor a PKR foszforilálja az eIF2α-t, hogy gátolja a vírus- és sejtfehérjeszintézist14,15,16.A PACT-t (PKR aktivátor fehérje) az első PKR aktivátor fehérjeként azonosították dsRNS17,18,19,20,21,22,23 hiányában.A PKR-rel való közvetlen kölcsönhatás révén a PACT különféle stresszeket (szérum éhezés, peroxid- vagy arzenitkezelés) alakít át a PKR-re és a downstream jelátviteli útvonalakra.Az eIF2α foszforilációja mellett a PACT által közvetített PKR aktiváció a stresszválaszhoz kapcsolódó különféle eseményeket vált ki, beleértve a megváltozott redox állapotot a PI3K/Akt24 útvonalon keresztül, a fokozott DNS-károsodás ellenőrzését a p5325,26 és NF-κB27,28 Szabályozza a transzkripciót, 29. Tekintettel a stresszválaszban, a proliferációban, az apoptózisban és más kulcsfontosságú sejtfolyamatokban betöltött kritikus szerepükre, a PKR és a PACT ígéretes terápiás célpontok számos betegség, különösen a rák esetében30, 31, 32, 33.E pleiotróp funkcionális és biológiai jelentősége ellenére azonban a PACT/PKR aktivitás szabályozása a rákos sejtekben továbbra is megfoghatatlan.
Az lncRNS-ek 200 nukleotidnál nagyobb transzkriptumok, amelyek nem tartalmaznak fehérjekódoló potenciált.Mióta az élvonalbeli teljes genom szekvenálási projektek több ezer lncRNS-t azonosítottak,35,36 sok erőfeszítést tettek biológiai funkcióik tisztázására.Egyre több kutatás kimutatta, hogy az lncRNS-ek számos biológiai folyamatban37 vesznek részt, beleértve az X-kromoszóma inaktivációjának szabályozását38,39, az imprinting40, a transzkripciót41,42, a transzlációt43 és még a rák növekedését is44,45,46,47.Ezek a tanulmányok arról számoltak be, hogy sok lncRNS vesz részt a PACT/PKR útvonalban.Az egyik ilyen tanulmány kimutatta, hogy az lncRNA ASPACT gátolta a PACT transzkripcióját és növelte a PACT mRNS sejtmagi retencióját.Más vizsgálatok kimutatták, hogy az lncRNS nc886 kötődik a PKR-hez, és gátolja annak foszforilációját49,50.Eddig nem számoltak be a PACT által közvetített PKR aktivációt szabályozó lncRNS-ről.
Az aszpartil-tRNS szintetáz antiszensz RNS 1-et (DARS-AS1) onkogén lncRNS-ként azonosították51,52,53,54.A miP-194-5p53, miP-12952 és miP-532-3p51 szabályozásán keresztül a DARS-AS1-ről kimutatták, hogy elősegíti a tiszta sejtes vesesejtes karcinóma, a pajzsmirigykarcinóma és a nem-kissejtes tüdőkarcinóma növekedését.Tong és munkatársai azt is megállapították, hogy a DARS-AS1 elősegíti a mielóma progresszióját azáltal, hogy fenntartja a protein 39 (RBM39) RNS-kötő motívum stabilitását.Azonban nem végeztek vizsgálatokat arra vonatkozóan, hogy ez az lncRNS részt vesz-e a PACT-PKR aktiválásának és a rákos sejtek stresszválaszának szabályozásában.
Itt nagyszabású funkcióvesztési szűrést végeztünk a CRISPRi rendszer segítségével, és megállapítottuk, hogy a DARS-AS1 lncRNS elősegíti többféle rákos sejt proliferációját.Ezen túlmenően, azonosítottunk egy fő mechanizmust: a DARS-AS1 közvetlenül kötődik a PACT-hez, gátolja a PACT és PKR kötődését, megakadályozza az eIF2α, egy alacsonyabb PKR szubsztrát foszforilációját, és végső soron gátolja az apoptotikus sejthalált.Összefoglalva, munkánk feltárja a DARS-AS1 lncRNS-t, mint a PACT-PKR útvonal szabályozóját, valamint a rák kezelésének és prognózisának lehetséges célpontját.
Kiterjedt genomiális profilalkotási vizsgálatok több száz lncRNS-t azonosítottak, amelyek a rákkal kapcsolatosak.Funkciójuk azonban nagyrészt ismeretlen56.A rák progressziójában részt vevő ígéretes lncRNS jelöltek azonosítása érdekében a CRISPRi rendszer segítségével funkcióvesztési szűrést végeztünk az SW620 vastagbélrák sejtvonal csökkent proliferációjára (1a. ábra).Az SW480 és SW620 vastagbélrák sejtvonalak egyedülálló tulajdonsága, hogy egyetlen beteg primer és másodlagos daganataiból származnak.Ez értékes összehasonlítást nyújt az előrehaladott vastagbélrák progressziójának genetikai változásainak tanulmányozásához.Ezért RNS-szekvenálás segítségével elemeztük a vastag- és végbélrák sejtvonalak (SW480 és SW620) transzkriptómáit, és összegyűjtöttünk néhány lehetséges funkcionális lncRNS-t a publikált irodalomból.Ezen eredmények alapján egy összevont sgRNS könyvtárat terveztünk, amely 7355 sgRNS oligót tartalmaz, amelyek 971 rákkal kapcsolatos lncRNS-t és 500 nem célzott sgRNS oligót céloznak meg negatív kontrollként (1. kiegészítő adat).
A CRISPRi rendszerrel végzett szűrés sematikus ábrázolása.b sgRNS dúsítás szűrés után.A vízszintes szaggatott vonal log2 (szoros változás) = ±0,58.A függőleges pontozott vonal p értéket = 0,05 jelöl.A fekete pontok a nem cél sgRNS-t jelentik (NC-nek jelölve).A piros pontok a DARS-AS1-et célzó sgRNS-ek.A kék pontok olyan sgRNS-ek, amelyek a LINC00205-öt célozzák, egy korábban leírt onkogén lncRNS-t.szoros változás = (normalizált leolvasás, 17. nap)/(normalizált leolvasás, 0. nap).c A DARS-AS1 sgRNS knockdown gátolta a sejtnövekedést.A hibasávok a három kísérlet ± szórását jelentik.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 kétoldali Student-féle t-próba.d DARS-AS1 expressziója tumorokban (TCGA adatkészlet).em A DARS-AS1 expressziója BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP és COAD betegek páros normál és tumormintáiban (TCGA adatkészlet).A p-értékeket páros, kétirányú Student-féle t-próbával kaptuk.
A plazmid megalkotása és a lentivírus csomagolása után négy független fertőzési kísérletben transzdukáltuk a dCas9-SW620 vastagbélrák sejtvonalat a fenti könyvtárral.A fertőzések multiplicitása (MOI) ezeknél a fertőzéseknél 0,1–0,3 volt, ami azt jelzi, hogy minden sejt csak egy sgRNS-sel transzfektálható.18 napos in vitro tenyésztés után a cél sgRNS-ek dúsítási profilja csökkent vagy nőtt a szűrést követően, míg a nem célzott kontroll oligonukleotidok száma viszonylag változatlan maradt a szűrés előtti profilhoz képest, ami azt jelzi, hogy célpontunk erősen szűrőspecifikus. könyvtár.Rizs.1b. és 1. kiegészítő táblázat). A LINC00205-öt, amelyről korábban azt állították, hogy elősegíti a tüdőrákot és a májrák progresszióját58, 59, 60, kiszűrték (log2 (szoros változás) < -0,58, p érték < 0,05), megerősítve a szűrés megbízhatóságát (1b. ábra). A LINC00205-öt, amelyről korábban azt állították, hogy elősegíti a tüdőrákot és a májrák progresszióját58, 59, 60, kiszűrték (log2 (szoros változás) < -0,58, p érték < 0,05), megerősítve a szűrés megbízhatóságát (1b. ábra). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). A LINC00205-öt, amelyről korábban beszámoltak arról, hogy elősegíti a tüdőrák és a májrák előrehaladását58, 59, 60, kizárták (log2 (szeres változás) <-0,58, p-érték <0,05), ami megerősíti a szűrés robusztusságát (.1b ábra) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). A LINC00205-öt, amelyről korábban bejelentették, hogy elősegíti a tüdő- és májrák progresszióját58, 59, 60, kizárták (log2 (szeres változás) <-0,58, p-érték <0,05), ami megerősíti a szűrés robusztusságát (.1b. ábra).
Az összes tesztelt lncRNS közül a DARS-AS1-et is szűrtük, és a három rokon sgRNS oligonukleotid szignifikánsan csökkent 18 napos tenyésztés után, ami arra utal, hogy ennek az lncRNS-nek a leütése csökkent rákproliferációt eredményezett (1b. ábra).Ezt az eredményt a vastagbélráksejtek MTS-analízise is alátámasztotta, amely azt mutatta, hogy a DARS-AS1 knockdown sejtek növekedési üteme csak felére csökkent a kontrollsejtekhez képest (1c. ábra), és összhangban van számos más ráktípusról szóló korábbi jelentésekkel.: tiszta sejtes veserák, pajzsmirigyrák és nem-kissejtes tüdőrák51,52,53,55.Funkciója és molekuláris mechanizmusai a vastag- és végbélrákban azonban továbbra is feltáratlanok.Ezért ezt az lncRNS-t választottuk további tanulmányozásra.
A DARS-AS1 expressziójának vizsgálatához betegekben átfogóan elemeztünk 10 327 daganatmintát a Cancer Genome Atlas (TCGA) projektből.Eredményeink azt mutatják, hogy a DARS-AS1 széles körben expresszálódik és szignifikánsan felszabályozott egészséges sejtekben számos daganatban, beleértve a vastagbél adenokarcinómát (COAD), a renális tiszta sejtes karcinómát (KIRC) és a vese papilláris sejtes karcinómát (KIRP)..Nagyon kevés (1d. ábra és 1a, b kiegészítő ábra). A páros egészséges/tumorminták elemzése tovább igazolta a DARS-AS1 szignifikánsan magasabb expresszióját a hólyag-uroteliális karcinóma (BLCA), a vesesejtes vesesejtes karcinóma (KIRC), a prosztata adenokarcinóma (PRAD), a tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) daganataiban. , uterine corpus endometrium carcinoma (UCEC), tüdő adenokarcinóma (LUAD), máj hepatocelluláris karcinóma (LIHC), vese vese papilláris sejtes karcinóma (KIRP) és vastagbél adenokarcinóma (COAD) (p érték < 0,05) (1e-m ábra) . A páros egészséges/tumorminták elemzése tovább igazolta a DARS-AS1 szignifikánsan magasabb expresszióját a hólyag-uroteliális karcinóma (BLCA), a vesesejtes vesesejtes karcinóma (KIRC), a prosztata adenokarcinóma (PRAD), a tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) daganataiban. , uterine corpus endometrium carcinoma (UCEC), tüdő adenokarcinóma (LUAD), máj hepatocelluláris karcinóma (LIHC), vese vese papilláris sejtes karcinóma (KIRP) és vastagbél adenokarcinóma (COAD) (p érték < 0,05) (1e-m ábra) .A páros egészséges/tumorminták elemzése szintén megerősítette a DARS-AS1 szignifikánsan magasabb expresszióját hólyag uroteliális karcinómában (BLCA), tiszta sejtes vese- és vesesejtes karcinómában (KIRC), prosztata adenokarcinómában (PRAD), tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) daganatokban., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , méhnyálkahártya karcinóma (UCEC), tüdő adenokarcinóma (LUAD), máj hepatocelluláris karcinóma (LIHC), vese papilláris sejtes karcinóma (KIRP) és vastagbél adenokarcinóma (COAD) (p érték < 0,05) (1e– m ábra) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0,05）(图1e-m）).配 对 健康 健康/肿瘤样本 的 分析 了 了 Dars-os1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（（） 肺腺癌 （（（） 肝肝 细胞癌 （（（）） 肾 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 （（肺腺癌 肺腺癌 （（（（（（（（（（肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 （（（（（（癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Az egészséges/tumorpáros minták analízise tovább erősítette a DARS-AS1 szerepét hólyag uroteliális karcinóma (BLCA), tiszta sejtes vesesejtes karcinóma (KIRC), prosztata adenokarcinóma (PRAD) és tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) daganatokban.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expressziója corpus uterine carcinomában (UCEC), tüdő adenokarcinómában (LUAD), hepatocelluláris karcinómában (LIHC), vese papilláris sejtes karcinómában (KIRP) és vastagbél adenokarcinómában (COAD) (p érték <0,05) (1e -m ábra).Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DARS-AS1 széles körben és erősen expresszálódik különféle rákos megbetegedésekben.
Mivel a DARS-AS1 és a DARS (az antiszensz szálat kódoló gén) ugyanazon a promóteren osztoznak, és egymás mellett helyezkednek el, az shRNS-t úgy terveztük, hogy specifikusan leütje a DARS-AS1-et, de nem a DARS-t (2a, b kiegészítő ábra és 2. kiegészítő táblázat). .Az SW620 mellett három másik, DARS-AS1-et erősen expresszáló sejtvonalat is használtunk az shRNS knockdown hatékonyságának és funkciójának tanulmányozására (3. kiegészítő táblázat).Eredményeink azt mutatták, hogy mindhárom kifejlesztett shRNS legalább 80%-os DARS-AS1 leütési hatékonyságot ért el, csekély hatással a DARS mRNS mennyiségére (kiegészítő 2c-f ábra).Ezenkívül azt találtuk, hogy a DARS-AS1 leütése ezekkel az shRNS-ekkel jelentősen gátolta a sejtnövekedést az SW620 (49,7%) és a HCT116 (27,7%) vastag- és végbélrák sejtvonalakban, valamint az MBA-MD-231 (53,4%) mellrák sejtvonalban.) és a HepG2 hepatóma sejtvonalat (92,7%-os csökkenés), valamint azon képességüket, hogy lehorgonyzott gömböket képeznek (átlagosan ~50,8%, 44,6%, 40,7% és 75,7% sejtvonalonként) (2a, b ábra).Az SW620-ban a telepképzési vizsgálat eredményei tovább erősítették, hogy a DARS-AS1 shRNS jelentősen gátolta a sejtproliferációt, átlagosan körülbelül 69,6%-os csökkenéssel (2c. ábra).
A kontroll shRNS és DARS-AS1 shRNS hatása a sejtproliferációra (a) és a szferoidképződésre (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 és HepG2 sejtekben.c Kontroll shRNS és DARS-AS1 shRNS hatása a kolóniaképzésre SW620 sejtekben.A DARS-AS1-et túlzottan expresszáló SW620 sejtek sejtproliferációja (d), szferoidképzés (e) és kolóniaképződés (f).A bemutatott adatok három kísérlet átlaga ± standard deviációja.*p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 és *** p ≤ 0,001 kétoldali Student-féle t-próbával.
A funkcióvesztési vizsgálatok kiegészítésére ezután létrehoztuk a DARS-AS1-et túlzottan expresszáló SW620 sejteket (2g. kiegészítő ábra).A DARS-AS1 túlzott expressziója szignifikánsan megnövelte a sejtnövekedést (1,8-szor), a nem horgonyzott szferoidok képződését (1,4-szeres) és a kolóniaképződést (3,3-szoros) az SW620 sejtekben (2d–f ábra).Ezt az eredményt egy másik DARS-AS1-et expresszáló sejtvonal, az A549 segítségével igazoltuk.A DARS-AS1 túlzott expressziója miatt megnövekedett sejtproliferációt az A549 sejtekben is megfigyelték (2h, i kiegészítő ábra és 3. kiegészítő táblázat).Összességében ezek a nyereség és veszteség vizsgálatok azt mutatják, hogy a DARS-AS1 elősegíti a rákos sejtek in vitro proliferációját.
Annak feltárására, hogy a DARS-AS1 milyen mechanizmussal szabályozza a sejtproliferációt, RNS-elemzést végeztünk, hogy azonosítsuk lehetséges fehérjekötő partnereit.Az RT-qPCR eredmények azt mutatták, hogy a DARS-AS1 körülbelül 86,2%-a az SW620 sejtek citoplazmájában található (3a. kiegészítő ábra).Az in vitro átírt biotinilált DARS-AS1-et vagy pszeudoRNS-t ezután SW620 sejtlizátumokkal inkubáltuk, majd SDS-PAGE elválasztást végeztünk.A későbbi ezüstfestés azt mutatta, hogy egy különálló sáv (~38 kDa) szignifikánsan feldúsult a DARS-AS1 mintákban, de nem az ál-RNS- vagy gyöngymintákban (3a. ábra).Ezt a sávot tömegspektrometriával (MS) PKR-aktiváló fehérjeként (PACT) azonosították, és immunblottal is megerősítették SW620, HCT116 és HepG2 sejtvonalakban (3a., b. ábra).A DARS és a rokon PACT fehérjék – PKR és TRBP – feldúsulását is vizsgáltuk Western blotting (WB) RNS analízissel.Az eredmények azt mutatták, hogy nem találtak közvetlen kölcsönhatást a DARS-AS1 RNS és e három fehérje között (3b. kiegészítő ábra).A DARS-AS1 és a PACT közötti specifikus kölcsönhatást tovább erősítette az RNS immunprecipitációs (RIP) analízis, amely azt mutatta, hogy a DARS-AS1 szignifikánsan feldúsult anti-PACT antitestekben, de más kontroll RNS-ekben nem (3c. ábra).Annak meghatározására, hogy a DARS-AS1 közvetlenül kölcsönhatásba lép-e a PACT-vel, egyéb sejtkomponensek hiányában, tisztított PACT alkalmazásával in vitro bioréteg interferometriás (BLI) vizsgálatot végeztünk.A biotinnal jelölt DARS-AS1 vagy ál-RNS-t streptavidin (SA) bioszenzorokon rögzítettük, majd 1 μM PACT-ot tartalmazó kinetikus pufferben inkubáltuk.Nevezetesen, a PACT erősen kötődött a DARS-AS1-hez (KD-érték ~26,9 nM), de nem utánozta az RNS-t (3d. ábra).Összességében ezek az eredmények közvetlen kölcsönhatást és nagy affinitást mutatnak a DARS-AS1 és a PACT között.
Az RNS pull elemzés azonosította a DARS-AS1-et, amely kölcsönhatásba lép a PACT-vel az SW620 sejtekben.Fent a rokon fehérjék ezüstfestése.Az alsóbb szintű immunblotokat anti-PACT antitesttel végeztük.b Az RNS pull-down analízist HCT116 (fent) és HepG2 (alul) sejtekben végeztük.A PACT dúsítását immunoblottal mutattuk ki.cRNS immunprecipitációs (RIP) vizsgálatokat végeztünk SW620 sejtekben a jelzett antitestek felhasználásával.d A PACT kötési görbéket a teljes hosszúságú DARS-AS1-hez vagy a kontroll RNS-hez biolayer interferometria (BLI) segítségével kaptuk.Az RNS-t streptavidin bioszenzoron rögzítettük.Az asszociáció mérésére 1 μM PACT-t használtunk.Az RNS pull assay-t biotinilált teljes hosszúságú DARS-AS1 vagy csonkolt (felül) alkalmazásával végeztük.Immunblot, amely a beérkezett PACT-t mutatja (alul).f A tisztított megjelölt PACT-et biotinilált teljes hosszúságú DARS-AS1-gyel inkubáltuk, vagy csonkoltuk (mint az e) pontban az in vitro RIP vizsgálathoz.Az extrahált RNS-t RT-qPCR-rel ellenőriztük.g A különböző RNS-fragmensek PACT-hez való relatív affinitását bioréteg interferometriával határoztuk meg.Az elemzéshez 100 nM RNS-t és 1 μM RAST-t használtunk.h Az in vitro RIP vizsgálatokat tisztított ép vagy csonkolt jelölt PACT alkalmazásával végeztük.Az extrahált RNS-t RT-qPCR-rel ellenőriztük.i A DARS-AS1, PACT vagy mindkettőt túltermelő SW620 sejtek növekedési üteme.j A teljes hosszúságú vagy csonkolt DARS-AS1 túlzott expressziója SW620 sejtekben eltérő hatással volt a sejtnövekedésre.k Apoptózist anti-PARP antitesttel végzett immunblottal mutattunk ki.l A DARS-AS1 kiütése az SW620 sejtek apoptózisát indukálja, amint azt az áramlási citometria mutatja.A bemutatott adatok három kísérlet átlaga ± standard deviációja. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kétirányú Student-féle t-próbával. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kétirányú Student-féle t-próbával. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kétirányú Student-féle t-próbával. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kétirányú Student-féle t-próbával.
Ezután három biotinilált DARS-AS1 RNS fragmentumot hoztunk létre in vitro transzkripcióval, hogy azonosítsuk a PACT asszociációhoz szükséges DARS-AS1 régiót (3e ábra).Az RNS-elemzés eredményei azt mutatták, hogy mindegyik fragmens képes volt kölcsönhatásba lépni a PACT-vel, de a 3'-terminális régió (384-768 nukleotid A3-mal jelölt) több mint 1-384 nukleotidot mutatott A1 jelzéssel) (3e. ábra).Hasonló eredményeket figyeltek meg a rekombináns PACT alkalmazásával végzett in vitro RIP vizsgálatban (3f. ábra).Ezekkel az eredményekkel összhangban az immobilizált RNS-fragmensek PACT-hez BLI-vel való kötésére irányuló kísérletek azt is kimutatták, hogy a PACT nagyobb affinitást mutat az A3-hoz (384–768 nt) (KD-érték körülbelül 94,6 nM), míg más területekkel szinte nincs kapcsolat.(3d. ábra).
Megvizsgáltuk a PACT kapcsolódó kötőrégióit is.A PACT három funkcionális domént tartalmaz, amelyek közül kettő konzervált kettős szálú RNS-kötő domén (dsRBD) és egy harmadik domén (D3), amely a fehérje kölcsönhatások aktivátoraként működik.Az egyes domének lncRNS-kötő képességének vizsgálatához három mutációt szerkesztettünk, amelyek eltávolították mind a három domént, és in vitro RIP-vizsgálatot végeztünk.Eredményeink azt mutatták, hogy a PACT harmadik doménjének (D3) deléciója szignifikánsan csökkentette a DARS-AS1-vel való interakcióját (0,11-szeresére az ép PACT-hez képest) a másik két mutációhoz képest (3h ábra), kimutatták, hogy a felszabadulás a D3 kölcsönhatásba lép a DARS-szel.-AC1.Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a DARS-AS1 és a PACT közötti interakció elsősorban a DARS-AS1 3′ végén és a PACT D3 doménjén keresztül történhet.
Megjegyeztük, hogy a DARS-AS1 nem volt hatással a PACT expressziójára, és a PACT nem volt hatással a DARS-AS1-re (3c. kiegészítő ábra).Ezután megvizsgáltuk a PACT knockdown hatását a sejtnövekedésre.A DARS-AS1-gyel ellentétben a relatív sejtek 1,5-3-szor gyorsabban növekedtek, amikor a PACT-t leütötték (3d. kiegészítő ábra).A telepképzési vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a sejtek 2-3-szoros telepeket képeztek PACT-vel végzett shRNS-kezelés után (kiegészítő 3e. ábra).Annak tesztelésére, hogy a DARS-AS1 szabályozza-e a sejtproliferációt a PACT-en keresztül, SW620 sejteket hoztunk létre, amelyek túlzottan expresszálják a PACT-et, a DARS-AS1-et vagy mindkettőt.A PACT túlzott expressziója a sejtproliferáció jelentős gátlását mutatta (3i. ábra).Míg a DARS-AS1 túlzott expressziója önmagában szignifikánsan elősegítette a sejtproliferációt, nem volt szignifikáns különbség a DARS-AS1-et és a PACT-et túltermelő sejtek növekedési ütemében.Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PACT ellensúlyozhatja a DARS-AS1 túlzott expressziója által okozott fokozott proliferációt.
Mivel a DARS-AS1 különböző régiói eltérő PACT-kötő képességgel rendelkeznek, megvizsgáltuk ezek relatív hatását a sejtproliferációra a DARS-AS1 fragmensek eltérő túlzott expressziójával.A másik két fragmenshez képest a DARS-AS1 a 3′ végén (384–768 nt) túlzottan expresszálódott, a DARS-AS1 fő PACT-vel kapcsolatos régiója, amely a legmagasabb sejtproliferációt stimuláló képességgel rendelkezett (3j. ábra).Ezek az eredmények pozitív korrelációt jeleznek a DARS-AS1 kötőképessége és biológiai funkciója között.
A PACT egy pro-apoptotikus fehérje19.Ezért megvizsgáltuk a DARS-AS1 hatását az apoptózisra.Ahogy az várható volt, a DARS-AS1 knockdown szignifikánsan megnövelte a PARP hasítását az SW620 sejtekben, és megnövelte az annexin V-pozitív sejtek arányát az SW620, HCT116, HepG2 és MBA-MD-231 sejtvonalakban (3k. ábra).3).3f – h), jelezve, hogy a DARS-AS1 anti-apoptotikus hatása a rákos sejtekben ellentétes a PACT apoptózist kiváltó funkciójával.Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DARS-AS1 onkogén funkciójának mechanizmusa a PACT funkció gátlásán keresztül valósulhat meg.
Ezt követően feltártuk a DARS-AS1-PACT asszociáció funkcionális vonatkozásait.A PACT arról számoltak be, hogy közvetlen kölcsönhatáson keresztül aktiválja a PKR-t, ami ezt követően fokozza az eIF2α foszforilációját, transzlációs deléciót és apoptózist okozva17.Először is megvizsgáltuk, hogy a DARS-AS1 befolyásolja-e a PACT és a PKR sejtes lokalizációját.A konfokális fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat azt mutatta, hogy a PACT és a PKR erősen kolokalizált az SW620 sejtekben, átlagos Pearson korrelációs együtthatója 0,72.Eközben a DARS-AS1 túlzott expressziója szignifikánsan csökkentette a PACT és a PKR együttes lokalizációját (átlagos Pearson korrelációs együttható 0,61) (4a. ábra).Annak vizsgálatára, hogy a DARS-AS1 módosíthatja-e a PACT-PKR kölcsönhatást, koimmunoprecipitációs (co-IP) vizsgálatot végeztünk anti-PACT antitesttel SW620 sejtlizátumokban.A PKR nagymértékben dúsult anti-PACT-ben a kontrollsejtekben, míg a PKR visszanyerése jelentősen csökkent a DARS-AS1-et túltermelő sejtekből származó lizátumokban (4b. ábra).Tisztított jelölt PACT-t és PKR-t használtunk az in vitro fehérjekötési vizsgálatokhoz.Ennek megfelelően azok, amelyek DARS-AS1-et biztosítottak, de nem kontroll RNS-t, elnyomott PACT-PKR kölcsönhatást mutattak (4c. ábra).Minden eredmény azt mutatta, hogy a DARS-AS1 megzavarta a PACT és a PKR kommunikációt.
a PACT és a PKR együttes lokalizációját a kontrollsejtekben vagy a DARS-AS1-et túlzottan expresszáló sejtekben figyelték meg konfokális fluoreszcens mikroszkóppal.A sejtmagokat DAPI-val festettük.A statisztikai eredményeket 16 fényképből kaptuk.b Koimmunprecipitáció (ko-IP) anti-PACT antitesttel kontroll SW620 sejtek sejtlizátumaiban vagy DARS-AS1-et túltermelő sejtekben.c Jelzett PACT-t, tisztított PKR-t és in vitro DARS-AS1-gyel vagy ál-RNS-sel átírt in vitro fehérjekötési analízishez inkubáltuk.Az immunprecipitációhoz anti-flag antitesteket használtunk.d Az immunblotokat a jelzett antitestekkel kontroll shRNS-sel vagy DARS-AS1-shRNS-sel transzfektált SW620 és HCT116 sejtekben végeztük, majd széruméhezést követtük.A DARS-AS1 expressziós szintje megváltoztatta a sejtek thapsigarginnal szembeni érzékenységét.Az SW620 sejteket DARS-AS1 shRNS-sel, DARS-AS1 overexpressziós plazmiddal vagy kontrollplazmiddal transzfektáltuk.A sejteket 48 órán át thapsigarginnal kezeltük, és a sejtek életképességét MTS reagenssel határoztuk meg.f In vitro átírt DARS-AS1 vagy ál-RNS-t és tisztított PACT-t használtunk az in vitro aktivációs vizsgálathoz és immunblot kimutatáshoz.g Az immunblotokat ezen antitestek felhasználásával SW620-ctrl sejteken (balra) vagy PKR mutánsokat túlzottan expresszáló sejteken (jobbra) végeztük.Ezeket a sejteket azután kontroll shRNS-sel vagy DARS-AS1-shRNS-sel transzfektáltuk, majd szérum éhezést követett el.h Áramlási citometria kimutatta, hogy a mutáns PKR inaktiválása kompenzálta a DARS-AS1 által kiváltott apoptózist az SW620 sejtekben.i A jelzett antitestekkel immunblotokat végeztünk SW620 (bal) vagy HCT116 (jobb) sejtekben.A kontroll shRNS-sel vagy DARS-AS1 shRNS-sel transzfektált sejtek szérummentesek, és 100 nM PKR C16 inhibitorral vagy DMSO-val vannak kiegészítve.Skálasáv = 5 µm.A bemutatott adatok három kísérlet átlaga ± standard deviációja.* p ≤ 0,05 kétoldali Student-féle t-próba.
Általában úgy gondolják, hogy amint a PACT kölcsönhatásba lép a PKR17-tel, a PKR foszforilációja indukálható a Thr451-nél.Eredményeink azt mutatták, hogy a PKR foszforiláció szintje szignifikánsan megemelkedett a DARS-AS1 knockdown sejtekben széruméhezés után (4d. ábra és 4a. kiegészítő ábra).Ennek megfelelően azt találtuk, hogy az eIF2α, a fő PKR szubsztrát foszforilációját is jelentősen megnövelte a DARS-AS1 shRNS (4d. ábra és 4a. kiegészítő ábra).A Thapsigargin egy ER stresszor, amely Ca2+ felszabadulását okozza az ER-ben.A thapsigargin-kezelésről beszámoltak arról, hogy indukálja a PACT expresszióját és aktiválását, amely tovább kölcsönhatásba lép a PKR-rel és aktiválja azt, ami apoptózishoz vezet az eIF2α foszforilációjának fokozásával18,61.Itt thapsigargint használtunk a PACT/PKR útvonal stimulátoraként, hogy megvizsgáljuk, vajon a DARS-AS1 segíthet-e a sejteknek a stressz leküzdésében a PACT/PKR útvonal gátlásával.Megfigyeltük, hogy a DARS-AS1 expresszió szintje pozitívan korrelált a sejt thapsigarginnal szembeni rezisztenciájával.A DARS-AS1-et túltermelő SW620 sejtek jobban túlélték, ha thapsigarginnal kezelték őket, míg a DARS-AS1 knockdown-os sejtek érzékenyebbé váltak (4e. ábra).Ezekkel az eredményekkel összhangban a DARS-AS1 túlzott expressziója csökkentette a thapsigargin által kiváltott PKR foszforilációt (4b. kiegészítő ábra).Ezzel szemben a thapsigargin kezelés után a PKR és az eIF2α nagyobb mértékben foszforilálódott a DARS-AS1 knockdown sejtekben, mint a kontrollsejtekben (4b. kiegészítő ábra).Érdekes módon a thapsigargin dózisfüggő módon indukálta a DARS-AS1 expresszióját, ami a DARS-AS1 stressz-ellenes funkciójára utalhat (4c. kiegészítő ábra).Ezenkívül in vitro aktiválási vizsgálatokat végeztünk ezen megfigyelések megerősítésére.Röviden, a PKR-t sejtlizátumokból tisztítottuk anti-PKR antitesttel, majd in vitro átírt rekombináns PACT-vel és DARS-AS1-gyel inkubáltuk.Az enzimes reakció után a foszfo-PKR-t WB segítségével detektáltuk.Eredményeink azt mutatták, hogy a PKR foszforilációját szignifikánsan gátolta a DARS-AS1, de a kontroll RNS nem (4f. ábra).Ezek az in vitro és in vivo eredmények arra utalnak, hogy a DARS-AS1 gátolja a PACT által közvetített PKR aktivációt.Ugyanakkor DARS-AS1 jelenlétében a PACT felépülésének csökkenését is megfigyeltük (4f ábra).Ez az eredmény összhangban van az in vitro fehérjekötési vizsgálat eredményeivel (4c. ábra), és ismét szemlélteti a DARS-AS1 blokkoló funkcióját a PACT-PKR asszociációban.
A PACT D3 doménjében lévő Ser246 és Ser287 szükséges a PKR aktiválásához celluláris stressz alatt.Két szerin-maradék alanin helyettesítése mutáns PACT-t (mutD) eredményezett, amely stressz nélkül aktiválta a PKR-t, az alanin helyettesítése (mutA) pedig megfordította a protokollt.Mivel kimutattuk ennek a doméneknek a fontosságát a DARS-AS1-gyel való közvetlen kapcsolatban, létrehoztuk ezt a két PACT-mutánst, hogy megvizsgáljuk, vajon ezek a maradékok részt vehetnek-e a DARS-AS1-gyel való kölcsönhatásban.Érdekes módon mindkét mutáns elvesztette a DARS-AS1-hez való kötődési képességét (4d. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy a PACT fehérje teljes szerkezetére lehet szükség a DARS-AS1-gyel való hatékony kölcsönhatáshoz.
Ezen túlmenően eredményeink arra is utalnak, hogy a sejtproliferáció DARS-AS1-shRNS-indukálta gátlása részben helyreállítható egy domináns negatív PACT-mutáns (PACTmutA) vagy egy domináns negatív PKR-mutáns (PKRmut) túlzott expressziójával (4e. e. kiegészítő ábra).A domináns-negatív PKR mutánsok túlzott expressziója csökkentette a DARS-AS1 knockdown által kiváltott PKR foszforilációt, valamint az eIF2α foszforilációt a szérumtól megfosztott sejtekben (4g. ábra).Ennél is fontosabb, hogy a DARS-AS1 knockdown által indukált apoptotikus sejtek aránya a PKRmut-ot túlzottan expresszáló sejtekben is csökkent (4h ábra és 4g kiegészítő ábra).A PKR kináz aktivitásának gátlása a DARS-AS1 funkciót is rontja, mivel az eredmények azt mutatták, hogy a DARS-AS1 leütés ritkán váltott ki PKR és eIF2α foszforilációt, amikor a sejteket PKR-specifikus C16 inhibitorral kezelték (4i. ábra és 4h. kiegészítő ábra).).Összességében eredményeink arra utalnak, hogy a DARS-AS1 legalább részben elősegíti a sejtproliferációt azáltal, hogy gátolja a PACT által közvetített PKR aktivációt.
A DARS-AS1 tumorgenezisben betöltött szerepének további feltárása érdekében in vivo kísérleteket végeztünk egér xenograft modell segítségével. Az eredmények azt mutatják, hogy a DARS-AS1 leütése drámaian csökkentette a tumornövekedést egerekben (p-érték < 0,0001) (5a. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy a DARS-AS1 leütése drámaian csökkentette a tumornövekedést egerekben (p-érték < 0,0001) (5a. ábra). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (5а). Az eredmények azt mutatják, hogy a DARS-AS1 knockdown drasztikusan csökkenti a tumornövekedést egerekben (p-érték < 0,0001) (5a. ábra).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（囀5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). Az eredmények azt mutatták, hogy a DARS-AS1 knockdown szignifikánsan csökkentette a tumornövekedést egerekben (p-érték < 0,0001) (5a. ábra).Így a DARS-AS1 knockdown csoportban szignifikánsan csökkent az átlagos tumortérfogat körülbelül 72,9%-kal és az átlagos tumortömeg körülbelül 87,8%-kal (5b-d ábra).Ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy a DARS-AS1 jelentősen elősegítheti a tumor növekedését in vivo.
Az ad DARS-AS1 leütés hatása a vastagbél onkogenezisére meztelen egerekben.A növekedési görbék (a), a tumor mérete (b), a tömeg (c) és a tumorképek (d) láthatók.A hibasávok ±SEM-et jelentenek. n = 10. ****p < 0,0001, kétirányú Student-féle t-próbával. n = 10. ****p < 0,0001, kétirányú Student-féle t-próbával. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 kétfarkú Student-féle t-próba.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 kétfarkú Student-féle t-próba.e Kaplan-Meier elemezte a DARS-AS1 expressziós szintje és a teljes túlélés közötti összefüggést UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM és LGG betegek esetében.A betegek magas DARS-AS1 expressziója a felső 50%-ban volt;a betegek DARS-AS1 expressziójának alacsony szintje az alsó 50%-ban volt.a p-értékeket log rank teszttel határoztuk meg.f Javasolt modell, amelyben a DARS-AS1 szabályozza a PACT-PKR útvonalat és a tumor növekedését.
A DARS-AS1 klinikai hatásának jobb megértése érdekében megvizsgáltuk a kifejeződése és a beteg túlélése közötti összefüggést.A TCGA adatkészlet elemzésével azt találtuk, hogy a magasabb DARS-AS1 expresszió az uvealis melanomával (UVM), a vese kromofóbiával (KICH), a vese papilláris sejtes karcinómával (KIRP), a mesotheliomával (MESO) és a multiplexel társult.Az alacsonyabb túlélés szignifikáns összefüggést mutatott a glioblasztóma morfózissal (GBM) és az alacsony fokú agyi gliomában (LGG) szenvedő betegekkel (5e. ábra).Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DARS-AS1 fontos szerepet játszhat a klinikai tumor progressziójában, és potenciális prediktív biomarker lehet többféle rák esetében.
Ebben a tanulmányban nagyszabású CRISPRi funkcionális szűréssel megállapítottuk, hogy a DARS-AS1 lncRNS legyőzi a rákos sejtek stresszét a két kulcsfontosságú stresszre reagáló, a PACT és a PKR szabályozásával.A PACT-tel való közvetlen kölcsönhatás révén a DARS-AS1 gátolta a PACT által közvetített PKR aktivációt, ezáltal megakadályozta az apoptotikus sejthalált és elősegítette a sejtproliferációt (5f. ábra).A DARS-AS1 felszabályozását több ráktípusban is megfigyelték, ami arra utal, hogy stresszes körülmények között a rákos sejtek túlélését elősegítő funkciója széles körben alkalmazható többféle rák esetében.
A PACT-t PKR aktivátor fehérjeként azonosították, és a PACT által közvetített PKR aktiváció fontos szerepet játszik a stresszválaszokban a transzkripció, a transzláció, az apoptózis és más fontos sejtfolyamatok szabályozása révén62.Évtizedek óta történtek kísérletek a PACT-PKR kaszkád rákspecifikus szabályozásának megértésére.Itt tanulmányunk a PACT-PKR eltérő szabályozási mechanizmusát tárta fel rákos sejtekben a celluláris lncRNS DARS-AS1 révén, amely közvetlenül kötődik a PACT-hez, blokkolja a PACT-PKR kölcsönhatást, gátolja a PKR aktivációt és az eIF2α foszforilációját, ezáltal gátolja a stressz által kiváltott apoptózist és serkenti a rák esetleges proliferációját.sejteket.Ez a felfedezés rávilágít a lehetséges lncRNS-célpontokra a rák prognózisában és terápiájában.
Adataink azt mutatták, hogy a DARS-AS1 knockdown érzékenyíti a sejteket a szérum éhezésre, a foszforilált PKR és az eIF2α jelentős növekedésével.Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a DARS-AS1 elősegíti a rákos sejtek túlélését zord körülmények között azáltal, hogy gátolja a PACT/PKR aktivitást.Számos más nem kódoló RNS, mint például az ASPACT és az nc886, szintén részt vesz a PACT/PKR tengelyben azáltal, hogy leszabályozza a PACT48 mRNS-t, vagy szabályozza az autofoszforilációt a PKR49, 50, 64 kötődésével.Közülük a DARS-AS1 a PACT-PKR társulás megzavarójaként működik.Ez a tanulmány gazdagítja a PACT/PKR tengely szabályozásáról és az lncRNS-ek stresszválaszokban betöltött szerepéről alkotott ismereteinket.
A PACT három különálló tartományt tartalmaz.Az első két dsRBD mindegyike elegendő a PACT PKR-hez való nagy affinitású kötődéséhez, míg a harmadik domén (D3) szükséges a PKR in vitro és in vivo aktiválásához.Vizsgálatunk kimutatta, hogy a DARS-AS1 elsősorban a D3 doménnel lép kölcsönhatásba (3h. ábra).Tekintettel az lncRNS nagy méretére (768 nukleotid), a DARS-AS1 D3-hoz való kötődése fizikailag gátolja a dsRBD és a PKR PACT doménje közötti kölcsönhatást, ezáltal blokkolja a PACT és a PKR asszociációját.A PACT pontmutációk, amelyek a Ser246-ot és a Ser287-et D3-ban alaninnal vagy aszpartáttal helyettesítették, megzavarták a DARS-AS1-hez való kötődési affinitását, rámutatva a D3 általános szerkezeti és elektromos tulajdonságainak fontosságára a kapcsolatukban.Ennek a mechanizmusnak a további részleteire lesz szükség a jövőben, pontosabb biokémiai elemzés és nagy felbontású PACT szerkezeti elemzés alkalmazásával.
Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a DARS-AS1 számos mechanizmuson keresztül elősegíti a sejtproliferációt51,52,53.Az egyik példában a kutatók azt figyelték meg, hogy a DARS-AS1 megnövelte az antiszensz fehérjét kódoló DARS gént azáltal, hogy a miP-194-5p-t megcélozta veseráksejtekben.A jelen tanulmányban azonban a DARS-AS1 leütése csekély hatással volt a DARS transzkripciójára többféle rák esetében, beleértve legalább a vastag- és végbélrákot, a mellrákot és a májrákot.Mivel az lncRNS-ek sejt- és szövetspecifikus expressziós mintázatot mutatnak, előfordulhat, hogy a funkcionális mechanizmusok nem konzerváltak a ráktípusok között, ami hozzájárulhat a megfigyeléseink és a különböző rákos megbetegedések korábbi értékelései közötti eltéréshez.Különféle fiziológiai és kóros folyamatok sajátos mechanizmusainak tisztázásához speciális vizsgálatok szükségesek.
A klinikai adatok elemzése kimutatta, hogy a daganatokban a DARS-AS1 expressziója fordítottan korrelál a rákos betegek túlélésével, ami aláhúzza a DARS-AS1/PACT/PKR tengely fontosságát a rák prognózisában.Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy a DARS-AS1 a PACT/PKR jelátviteli tengely szabályozója, elősegíti a rákos sejtek proliferációját és gátolja az apoptózist a stresszválasz során, ami egy másik kutatási irányt jelent, és érdekes lehet a lehetséges kezelések jövőbeli kutatása számára. .
Az SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 és HEK293T humán sejtvonalakat a kínai National Cell Line Resource Infrastructure-tól szereztük be.Minden sejtet DMEM tápközegben (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), amelyet 10% FBS-sel (Gemini, Brooklyn, NY) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (Thermo Fisher Scientific) egészítettünk ki, 37 °C-on, 5% CO2-on.inkubátor.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (foszfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (foszfor S246), Abgens (AP7744b);anti-p-tubulin, CST (2128);normál egér IgG, CST (5415S);normál nyúl IgG, CST (2729S).Az antitesteket 1:1000 arányban hígítottuk PBST-ben Western-blothoz és 1:100 arányban IP-hez.
Az sgRNS-eket egy nyilvánosan elérhető CRISPR-ERA66 nevű eszköz segítségével fejlesztették ki.Az sgRNS fejlesztéshez az alapértelmezett eszközparamétereket használtuk, és az algoritmus kiszámította az sgRNS kötőhelyeket a 3 kb-os régióban.középpontjában a TSS.Az sgRNS-oligonukleotid-készleteket a CustomArray, Inc.-nél (Bothewell, WA) szintetizáltuk, és humanizált pgRNS-plazmidokba klónoztuk (Addgene #44248).Összesen 12 µg egyesített humanizált pgRNS plazmidot, 7,2 µg psPAX2-t (Addgene #12260) és 4,8 µg pMD2.G-t (Addgene #12259) kotranszfektáltunk 5 x 106 HEK293T-t használva DNS Transfectafe cm-ben. sejteket (CWBIO, Peking, Kína) a gyártó utasításait követve.A vírustartalmú felülúszókat a transzfekció után 48 és 72 órával összegyűjtöttük, és egy 0,45 µm-es szűrőn átszűrtük.A szűréshez a dCas9/KRAB fúziós fehérjét expresszáló SW620 sejteket vírustranszdukcióval nyertük.A módosított SW620 sejteket négy független fertőzési kísérletben fertőztük meg a víruskönyvtárral 0,1-0,3 MOI-val, és 2 μg/ml puromicinnel (Sigma, St. Louis, MO) vettünk mintát 2 napon keresztül.Ezt követően a sejteket 18 napig in vitro tenyésztjük, a szűréshez a könyvtár minimális lefedettsége 500 sejt/sgRNS.
A genomi DNS-t a QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Németország; 51183) utasításai szerint extraháltuk.Összesen 100 μg genomiális DNS-t használtak biológiai ismétlésenként a könyvtár felépítéséhez.Az sgRNS-régiót két PCR-körrel amplifikáltuk, és vonalkódhoz kapcsoltuk.
A PCR-termékeket NucleoSpin® géllel és PCR-tisztító készlettel (MACHEREY-NAGEL, Düren, Németország; 740609.250) tisztítottuk, és mennyiségileg Qubit™ HS kétszálú DNS-detektáló készlettel (Thermo Fisher Scientific; Q32854) határoztuk meg.
A sejtproliferáció mérésére az MTS vizsgálatot alkalmaztuk.A sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk 2000 sejt/lyuk kezdeti sűrűséggel.A sejtek relatív számát naponta, a jelzett időpontban mértük összesen 4-6 napon keresztül.Minden egyes lyukhoz 20 μl MTS reagenst (Promega) hígítottunk 100 μl DMEM-mel, inkubáltuk a sejtekkel 4 órán át 37 °C-on, majd megmértük az OD490-et.
A horgonytalan növekedés képességét a gömbök kialakulásának elemzésével fedezték fel.Röviden, 2000 shRNS DARS-AS1 vagy kontroll shRNS-sel transzfektált sejtet ultra alacsony kötődésű mikrolemezeken (Corning) tenyésztettünk, 4 naponként cserélve a táptalajt.A szferoidokat 14 nap elteltével megszámoltuk.500 DARS-AS1 overexpressziós plazmiddal vagy kontrollplazmiddal transzfektált sejtet használtunk a fokozási vizsgálathoz, egyébként a módszer változatlan maradt.
Az RNS-t T7 RNS polimeráz és biotin-16-UTP (Roche 1138908910) alkalmazásával írtuk át a Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) utasításai szerint.Az itt használt primereket a 4. kiegészítő táblázat tartalmazza.
A fehérjét kódoló PACT vagy PKR régiókat pET15b-be (Addgene #73619) klónoztuk, és BL21(DE3)-ba transzformáltuk.A baktériumokat egy éjszakán át ampicillinnel ellátott LB-ben inkubáltuk, majd 100-szorosára hígítottuk friss LB-vel.Amikor a tápközeg OD600 értéke elérte a 0,8-at, 1 mM IPTG-t adtunk hozzá a fehérje expressziójának indukálására.Egy éjszakán át enyhe rázatással (250 fordulat/perc 20 °C-on) végzett inkubálás után a sejtpelletet centrifugálással (4000 fordulat/perc, 10 perc, 4 °C) összegyűjtöttük.Szuszpendálja újra a sejtüledéket lízispufferben (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF), és inkubálja jégen 30 percig, majd ultrahangos kezeléssel (15 perc, 5 másodperc be/ki, jégen) és centrifugálja (13 000) fordulat)., 30 perc, 4°С).A felülúszót ezután Ni-NTA gyantára (QIAGEN) töltöttük háromszor 4 °C-on, 4-szer mostuk mosópufferrel (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl), és háromszor eluáltuk, összesen összesen. 10 ml eluens puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).A tisztított fehérjét WB alkalmazásával határoztuk meg, a koncentrációt pedig a Qubit™ protein assay kit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) segítségével határoztuk meg.
A RIP vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük, módosításokkal.Röviden, 1x RIP puffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNazin ribonukleáz inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteáz) lizálja a citosztatikus 7 koktélt 1 x (Roche, 1 mM DTT) és centrifugáljuk 13 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig 4 °C-on.A felülúszót ezután 5 μg anti-PACT antitesttel (Abeam) vagy IgG-vel (CST) konjugált protein A+G mágneses gyöngyökkel (Millipore) inkubáltuk.A gyöngyöket ötször mostuk 5x RIP pufferrel, majd proteináz K-val (NEB) emésztettük.Az RNS-t Trizollal extraháltuk és RT-qPCR-rel határoztuk meg.A primereket az 5. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Az in vitro RIP vizsgálatot módosított standard RIP vizsgálati protokoll szerint végeztük.Összesen 5 pmol in vitro átírt RNS-t 1x hígítottunk RIP pufferrel és 65 °C-on 5 percig inkubálva, majd lassan szobahőmérsékletre hűtöttük.Összesen 5 pmol ép vagy mutált, flag-jelzett PACT fehérjét tisztítottunk E. coli-ból.Inkubálja a renaturált RNS-sel 2 órán át 4 °C-on, és kövesse a fenti eljárást az anti-flag IP RIP analíziséhez.
Az RNS kiterjesztési analízishez 1x107 sejtet lizáltunk 1xRIP pufferrel.13 000 fordulat/perc sebességgel, 15 percig 4 °C-on végzett centrifugálás után a felülúszót 30 μl sztreptavidin mágneses gyöngyökkel (Beckman) előkezeltük 2 órán át 4 °C-on.A tisztított lizátumot ezután élesztőgomba-tRNS-sel láttuk el, és 40 pmol renaturált RNS-sel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on, majd további 2 órán át, és 20 μl új, BSA-val blokkolt sztreptavidin mágneses gyöngyöt adtunk hozzá.A mosási lépés négyszer 5x RIP pufferrel és 4 alkalommal 1x RIP pufferrel állt.A megfelelő fehérjéket biotinelúciós pufferrel (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) eluáltuk, és NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) segítségével szétválasztottuk.Ezüstfestés (Beyotime Biotechnology) után bizonyos sávokat kimetszett, és MS-vel elemzett.
Co-IP analízist végeztünk a PACT és a PKR közötti kölcsönhatás tesztelésére.Röviden, a felülúszó lizátumokat úgy készítettük el, hogy 1 x 107 lizált sejtet 1 x RIP pufferben inkubáltunk, majd centrifugáltunk 13 000 fordulat/perc mellett 15 percig 4 °C-on.A lizátumokat protein A + G mágneses gyöngyökkel töltöttük, 5 µg anti-PACT antitesttel konjugáltuk, és egy éjszakán át óvatosan forgattuk 4 °C-on.A gyöngyöket háromszor mostuk 5×RIP pufferrel, kétszer 1×RIP pufferrel, és 1×SDS pufferrel eluáltuk.A visszanyert fehérjét SDS-PAGE géllel elemeztük, és WB-vel detektáltuk.
Két pmol megjelölt PACT-t és 1 pmol PKR-t tisztítottunk E. coli-ból.Hígítsuk fel 1× RIP pufferrel, és inkubáljuk 10 pmol renaturált RNS-sel 2 órán át 4 °C-on.Ezt követően protein A+G mágneses gyöngyökkel konjugált anti-jelölt antitesttel inkubáltuk további két órán át.A gyöngyöket ezután négyszer mostuk 1x RIP pufferrel, és 1x SDS pufferrel eluáltuk.A kapott PACT-t és PKR-t a WB detektálta.