hírek

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A hatékony fényérzékenyítők különösen fontosak a fényterápia széles körű klinikai alkalmazása szempontjából.A hagyományos fényérzékenyítők azonban általában szenvednek a rövid hullámhosszú abszorpciótól, az elégtelen fotostabilitástól, a reaktív oxigénfajták (ROS) alacsony kvantumhozamától és a ROS aggregáció által kiváltott kioltásától.Itt egy közel-infravörös (NIR) szupramolekuláris fényérzékenyítőt (RuDA) mutatunk be, amelyet Ru (II)-arén fémorganikus komplexek vizes oldatban történő önszerveződése közvetít.A RuDA csak aggregált állapotban képes szingulett oxigént (1O2) generálni, és nyilvánvaló aggregáció által kiváltott 1O2-generációs viselkedést mutat a szingulett-triplet rendszer közötti keresztezési folyamat jelentős növekedése miatt.A 808 nm-es lézerfény hatására a RuDA 16,4%-os 1O2 kvantumhozamot (FDA által jóváhagyott indocianin zöld: ΦΔ=0,2%) és magas, 24,2%-os fototermikus konverziós hatékonyságot (kereskedelmi arany nanorudak) mutat, kiváló fotostabilitás mellett.: 21,0%, arany nanohéjak: 13,0%).Ezen túlmenően, a jó biokompatibilitással rendelkező RuDA-NP-k előnyösen felhalmozódhatnak a tumor helyén, jelentős tumorregressziót okozva a fotodinamikus terápia során, a tumor térfogatának in vivo 95,2%-os csökkenésével.Ez az aggregációt fokozó fotodinamikus terápia stratégiát ad a kedvező fotofizikai és fotokémiai tulajdonságokkal rendelkező fényérzékenyítő szerek kifejlesztésére.
A hagyományos terápiához képest a fotodinamikus terápia (PDT) vonzó kezelési módszer a rák kezelésére olyan jelentős előnyei miatt, mint a pontos spatiotemporális kontroll, a non-invazivitás, az elhanyagolható gyógyszerrezisztencia és a mellékhatások minimalizálása 1,2,3.Fénybesugárzás hatására az alkalmazott fotoszenzibilizátorok aktiválódhatnak, és nagyon reaktív oxigénfajtákat (ROS) képeznek, ami apoptózishoz/nekrózishoz vagy immunválaszokhoz vezet4,5. Azonban a legtöbb hagyományos fényérzékenyítő szerek, mint például a klórok, porfirinek és antrakinonok, viszonylag rövid hullámhosszú abszorpcióval rendelkeznek (frekvencia < 680 nm), így gyenge fénypenetrációt eredményez a biológiai molekulák (pl. hemoglobin és melanin) intenzív abszorpciója miatt. a látható régió6,7. Azonban a legtöbb hagyományos fényérzékenyítő szerek, mint például a klórok, porfirinek és antrakinonok, viszonylag rövid hullámhosszú abszorpcióval rendelkeznek (frekvencia < 680 nm), így gyenge fénypenetrációt eredményez a biológiai molekulák (pl. hemoglobin és melanin) intenzív abszorpciója miatt. a látható régió6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. A legtöbb elterjedt fényérzékenyítő szerek, mint például a klórok, porfirinek és antrakinonok azonban viszonylag rövid hullámhossz-abszorpcióval rendelkeznek (< 680 nm), ami gyenge fénypenetrációt eredményez a biológiai molekulák (pl. hemoglobin és melanin) látható tartományba történő intenzív abszorpciója miatt6,7.然而 ， 大多数 传统 的 ， ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， ， 相对 较 短 的 波长 （频率 频率 频率）） 因此 对 生物 分子 如 如 血红 和））） 强烈 吸收 ， ， ， ， ， ， ， 由于 对 生物 生物 波长 波长 波长 因此 因此导致光穿透性差.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差. Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Azonban a legtöbb hagyományos fényérzékenyítő szer, mint például a klórok, porfirinek és antrakinonok, viszonylag rövid hullámhossz-abszorpcióval rendelkeznek (frekvencia < 680 nm) a biomolekulák, például a hemoglobin és a melanin erős abszorpciója miatt, ami gyenge fénypenetrációt eredményez.Látható terület 6.7.Ezért a közeli infravörös (NIR) elnyelő fényérzékenyítők, amelyek a 700–900 nm-es „terápiás ablakban” aktiválódnak, jól alkalmasak fényterápiára.Mivel a közeli infravörös fényt a biológiai szövetek abszorbeálják a legkevésbé, ez mélyebb behatoláshoz és kisebb fénykárosodáshoz vezethet8,9.
Sajnos a meglévő NIR-elnyelő fényérzékenyítők általában gyenge fotostabilitással, alacsony szingulett oxigén (1O2) termelő kapacitással és aggregáció által kiváltott 1O2 kioltással rendelkeznek, ami korlátozza klinikai alkalmazásukat10,11.Bár nagy erőfeszítéseket tettek a hagyományos fényérzékenyítő szerek fotofizikai és fotokémiai tulajdonságainak javítására, eddig számos jelentés számolt be arról, hogy a NIR-elnyelő fényérzékenyítő szerek mindezen problémákat megoldhatják.Ezenkívül számos fényérzékenyítő ígéretet mutatott az 1O212, 13, 14 hatékony előállítására 800 nm feletti fénnyel besugározva, mivel a fotonenergia gyorsan csökken a közeli infravörös tartományban.A trifenil-amin (TFA) elektrondonorként és az [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazin (TDP) mint elektronakceptor csoport Donor-akceptor (DA) típusú festékek egy osztálya közeli infravörös sugárzást elnyelő festékek, amelyeket széles körben tanulmányoztak a közeli infravörös bioimaging II és a fototermális terápia (PTT) terén szűk sávszélességük miatt.Így a DA-típusú festékek használhatók PDT-hez közel IR gerjesztéssel, bár ritkán tanulmányozták PDT fényérzékenyítőként.
Köztudott, hogy a fényérzékenyítő szerek rendszerközi keresztezésének (ISC) nagy hatékonysága elősegíti az 1O2 képződését.Az ISC-folyamat előmozdításának általános stratégiája a fényérzékenyítők spin-orbit coupling (SOC) erősítése nehéz atomok vagy speciális szerves részek bevezetésével.Ennek a megközelítésnek azonban még vannak hátrányai és korlátai19,20.A közelmúltban a szupramolekuláris önösszeállítás egy alulról felfelé építkező intelligens megközelítést biztosított funkcionális anyagok molekuláris szintű előállításához,21,22, amely számos előnnyel jár a fototerápiában: (1) az önösszeszerelt fotoszenzibilizátorok szalagszerkezeteket képezhetnek.Hasonló az elektronikus szerkezetekhez, amelyeknél az építőelemek közötti átfedő pályák miatt sűrűbb az energiaszint-eloszlás.Ezért az alsó szingulett gerjesztett állapot (S1) és a szomszédos triplett gerjesztett állapot (Tn) közötti energiaegyeztetés javulni fog, ami előnyös a 23, 24 ISC folyamat számára.(2) A szupramolekuláris összeszerelés csökkenti az intramolekuláris mozgáskorlátozási mechanizmuson (RIM) alapuló nem sugárzó relaxációt, amely szintén elősegíti az ISC folyamatot 25, 26 .(3) A szupramolekuláris szerelvény megvédheti a monomer belső molekuláit az oxidációtól és lebomlástól, ezáltal nagymértékben javítja a fényérzékenyítő fotostabilitását.Tekintettel a fenti előnyökre, úgy gondoljuk, hogy a szupramolekuláris fényérzékenyítő rendszerek ígéretes alternatívát jelenthetnek a PDT hiányosságainak leküzdésére.
A Ru(II)-alapú komplexek ígéretes orvosi platformot jelentenek a betegségek diagnosztizálásában és terápiájában való alkalmazásra, egyedülálló és vonzó biológiai tulajdonságaik miatt28,29,30,31,32,33,34.Ezen túlmenően a Ru(II) alapú komplexek gerjesztett állapotainak bősége és hangolható fotofizikokémiai tulajdonságai nagy előnyt jelentenek a Ru(II) alapú fényérzékenyítők fejlesztéséhez35,36,37,38,39,40.Figyelemre méltó példa a ruténium(II)-polipiridil-komplex TLD-1433, amely jelenleg II. fázisú klinikai vizsgálatok alatt áll, mint fényérzékenyítő szer a nem izom-invazív hólyagrák (NMIBC) kezelésére41.Ezenkívül a ruténium(II)-arén fémorganikus komplexeket széles körben használják kemoterápiás szerekként a rák kezelésére alacsony toxicitásuk és könnyű módosíthatóságuk miatt42, 43, 44, 45.A Ru(II)-arén fémorganikus komplexek ionos tulajdonságai nemcsak a DA kromoforok közönséges oldószerekben való rossz oldhatóságát javíthatják, hanem a DA kromoforok összeállítását is.Ezenkívül a Ru(II)-arének fémorganikus komplexeinek pszeudooktaéderes félszendvics szerkezete sztérikusan megakadályozhatja a DA-típusú kromoforok H-aggregációját, ezáltal elősegítve a vöröseltolódott abszorpciós sávokkal rendelkező J-aggregáció kialakulását.Azonban a Ru(II)-arén komplexek inherens hátrányai, mint például az alacsony stabilitás és/vagy rossz biológiai hozzáférhetőség, befolyásolhatják az arén-Ru(II) komplexek terápiás hatékonyságát és in vivo aktivitását.A vizsgálatok azonban kimutatták, hogy ezek a hátrányok kiküszöbölhetők, ha a ruténiumkomplexeket biokompatibilis polimerekkel fizikai kapszulázással vagy kovalens konjugációval kapszulázzák.
Ebben a munkában a Ru(II)-arén (RuDA) DA-konjugált komplexeit mutatjuk be NIR triggerrel a DAD kromofor és a Ru(II)-arén rész közötti koordinációs kötésen keresztül.Az így létrejövő komplexek nem kovalens kölcsönhatások következtében a vízben fémszupramolekuláris vezikulákká alakulhatnak.Nevezetesen, a szupramolekuláris összeállítás a RuDA-t polimerizáció által kiváltott rendszerközi keresztezési tulajdonságokkal ruházta fel, ami jelentősen növelte az ISC hatékonyságát, ami nagyon kedvező volt a PDT számára (1A. ábra).A tumor felhalmozódásának és az in vivo biokompatibilitás növelése érdekében az FDA által jóváhagyott Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) segítségével a RuDA47,48,49 kapszulázott RuDA-NP nanorészecskéket hoztak létre (1B. ábra), amelyek rendkívül hatékony PDT/Dual- mód PTT proxy .A rák fototerápiájában (1C. ábra) a RuDA-NP-t MDA-MB-231 daganatos meztelen egerek kezelésére alkalmazták a PDT és PTT hatékonyságának in vivo tanulmányozására.
A RuDA fotofizikai mechanizmusának sematikus illusztrációja monomer és aggregált formákban rák fototerápiához, B RuDA-NP-k és C RuDA-NP-k szintézise NIR-aktivált PDT-hez és PTT-hez.
A TPA és TDP funkcionalitásból álló RuDA-t az 1. kiegészítő ábrán (2A. ábra) bemutatott eljárás szerint állítottuk elő, és a RuDA-t 1H és 13C NMR spektrumokkal, elektropermet ionizációs tömegspektrometriával és elemanalízissel jellemeztük (kiegészítő 2-4. ábra). ).A legalacsonyabb szingulett átmenet RuDA elektronsűrűség-különbség térképét időfüggő sűrűségfüggvény elmélettel (TD-DFT) számítottuk ki a töltésátviteli folyamat tanulmányozására.Amint az 5. kiegészítő ábrán látható, az elektronsűrűség elsősorban a trifenil-amintól a TDP-akceptor egységig sodródik a fotogerjesztést követően, ami egy tipikus intramolekuláris töltéstranszfer (CT) átmenetnek tulajdonítható.
Az érc kémiai szerkezete B Az érc abszorpciós spektruma DMF és víz különböző arányú keverékeiben.C A RuDA (800 nm) és ICG (779 nm) normalizált abszorpciós értékei az idő függvényében 0,5 W cm-2 808 nm-es lézerfénynél.D Az ABDA fotodegradációját jelzi, hogy különböző víztartalmú DMF/H2O keverékekben 808 nm hullámhosszú, 0,5 W/cm2 teljesítményű lézersugárzás hatására RuDA-indukált 1O2 képződése következik be.
Absztrakt – UV-látható abszorpciós spektroszkópiát alkalmaztak az érc önszerveződési tulajdonságainak tanulmányozására DMF és víz különböző arányú keverékében.ábrán látható módon.A 2B. ábrán a RuDA 600 és 900 nm közötti abszorpciós sávokat mutat DMF-ben, maximális abszorpciós sávja pedig 729 nm-nél.A víz mennyiségének növelése az érc abszorpciós maximumának fokozatos vöröseltolódásához vezetett 800 nm-re, ami az érc J-aggregációját jelzi az összeszerelt rendszerben.A RuDA fotolumineszcencia spektruma különböző oldószerekben a 6. kiegészítő ábrán látható. Úgy tűnik, hogy a RuDA tipikus NIR-II lumineszcenciát mutat, maximális emissziós hullámhossza kb.1050 nm CH2Cl2-ben és CH3OH-ban.A RuDA nagy Stokes-eltolódása (kb. 300 nm) a gerjesztett állapot geometriájának jelentős változását és az alacsony energiájú gerjesztett állapotok kialakulását jelzi.Az érc lumineszcenciakvantumhozama CH2Cl2-ben és CH3OH-ban 3,3, illetve 0,6% volt.Metanol és víz keverékében (5/95, v/v) azonban az emisszió enyhe vöröseltolódása és a kvantumhozam csökkenése (0,22%) volt megfigyelhető, ami az Ore önszerveződésének tudható be. .
Az ORE önszerelődésének megjelenítéséhez folyékony atomerőmikroszkópiát (AFM) használtunk, hogy vizualizáljuk az ORE morfológiai változásait a metanol oldatban víz hozzáadása után.Amikor a víztartalom 80% alatt volt, nem figyeltek meg egyértelmű aggregációt (7. kiegészítő ábra).A víztartalom további 90-95%-os növekedésével azonban kis nanorészecskék jelentek meg, amelyek az érc önszilárdulását jelezték, emellett a 808 nm hullámhosszú lézeres besugárzás nem befolyásolta a RuDA vizes abszorpciós intenzitását megoldást (2C. ábra és 8. kiegészítő ábra).Ezzel szemben az indocianin zöld (ICG mint kontroll) abszorbanciája gyorsan csökkent 779 nm-en, ami a RuDA kiváló fotostabilitását jelzi.Ezenkívül a RuDA-NP-k stabilitását PBS-ben (pH = 5,4, 7,4 és 9,0), 10% FBS-ben és DMEM-ben (magas glükóz) vizsgáltuk UV-látható abszorpciós spektroszkópiával különböző időpontokban.Amint az a 9. kiegészítő ábrán látható, a RuDA-NP abszorpciós sávjaiban enyhe változásokat figyeltek meg PBS-ben 7,4/9,0 pH-n, FBS-ben és DMEM-ben, ami a RuDA-NP kiváló stabilitását jelzi.Azonban savas közegben (рН = 5,4) az érc hidrolízisét észlelték.Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerekkel tovább értékeltük a RuDA és a RuDA-NP stabilitását is.Amint az a 10. kiegészítő ábrán látható, a RuDA stabil volt metanol és víz keverékében (50/50, v/v) az első órában, és a hidrolízist 4 óra elteltével figyelték meg.A RuDA NP-k esetében azonban csak egy széles konkáv-konvex csúcs volt megfigyelhető.Ezért gélpermeációs kromatográfiát (GPC) alkalmaztunk a RuDA NP-k stabilitásának meghatározására PBS-ben (pH = 7,4).Amint az a 11. kiegészítő ábrán látható, a vizsgált körülmények között 8 órás inkubáció után az NP RuDA csúcsmagassága, csúcsszélessége és csúcsterülete nem változott jelentősen, ami az NP RuDA kiváló stabilitását jelzi.Ezenkívül a TEM-felvételek azt mutatták, hogy a RuDA-NP nanorészecskék morfológiája gyakorlatilag változatlan maradt 24 óra elteltével hígított PBS pufferben (pH = 7,4, 12. kiegészítő ábra).
Mivel az önszilárdulás különböző funkcionális és kémiai jellemzőket adhat az ércnek, megfigyeltük a 9,10-antracéndiil-bisz(metilén)-dimalonsav (ABDA, indikátor 1O2) felszabadulását metanol-víz keverékekben.Eltérő víztartalmú érc50.Amint az a 2D ábrán és a 13. kiegészítő ábrán látható, az ABDA lebomlását nem figyelték meg, ha a víztartalom 20% alatt volt.A páratartalom 40%-os növekedésével az ABDA lebomlása következett be, amit az ABDA fluoreszcencia intenzitásának csökkenése bizonyít.Azt is megfigyelték, hogy a magasabb víztartalom gyorsabb lebomlást eredményez, ami arra utal, hogy a RuDA önszerveződése szükséges és előnyös az ABDA lebomlásához.Ez a jelenség nagyban különbözik a modern ACQ (aggregáció-indukált kioltás) kromoforoktól.808 nm hullámhosszú lézerrel besugározva az 1O2 RuDA kvantumhozama 98% H2O/2% DMF keverékben 16,4%, ami 82-szer magasabb, mint az ICG (ΦΔ = 0,2%)51, figyelemreméltó termelési hatékonyságot mutat be az 1O2 RuDA aggregált állapotban.
Elektron spinek 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinon (TEMP) és 5,5-dimetil-1-pirrolin-N-oxid (DMPO) felhasználásával spincsapdákként. AFK.a RuDA által.Amint az a 14. kiegészítő ábrán látható, megerősítést nyert, hogy 0 és 4 perc közötti besugárzási időkben 1O2 keletkezik.Ezen túlmenően, amikor a RuDA-t DMPO-val inkubáltuk besugárzás mellett, egy tipikus négysoros EPR-jelet észleltünk, amely 1:2:2:1 arányú DMPO-OH· addukt volt, ami hidroxilgyökök (OH·) képződésére utal.Összességében a fenti eredmények azt mutatják, hogy a RuDA képes stimulálni a ROS-termelést egy kettős I/II-es típusú fotoszenzitizációs folyamaton keresztül.
A RuDA monomer és aggregált formájú elektronikus tulajdonságainak jobb megértése érdekében a RuDA határmolekulapályáit monomer és dimer formában DFT módszerrel számítottuk ki.ábrán látható módon.A 3A. ábrán a monomer RuDA legmagasabban elfoglalt molekulapályája (HOMO) delokalizálódik a ligandum gerince mentén, és a legalacsonyabb foglalt molekulapálya (LUMO) a TDP akceptor egységen helyezkedik el.Éppen ellenkezőleg, a dimer HOMO elektronsűrűsége egy RuDA molekula ligandumára koncentrálódik, míg a LUMO elektronsűrűsége főként egy másik RuDA molekula akceptor egységére koncentrálódik, ami azt jelzi, hogy a RuDA a dimerben van.A CT jellemzői.
A Az Ore HOMO-ját és LUMO-ját monomer és dimer formában számítják ki.B Az érc szinglet és triplett energiaszintjei monomerekben és dimerekben.C A RuDA és a lehetséges ISC-csatornák becsült szintjei monomer C-ként és dimer D-ként. A nyilak jelzik a lehetséges ISC-csatornákat.
Az elektronok és lyukak eloszlását a RuDA kisenergiájú szingulett gerjesztett állapotaiban monomer és dimer formában a Multiwfn 3.852.53 szoftverrel elemeztük, amelyeket TD-DFT módszerrel számítottunk ki.A kiegészítő címkén feltüntetettek szerint.Amint az 1-2. ábrán látható, a monomer RDA lyukak többnyire a ligandum gerince mentén delokalizálódnak ezekben a szingulett gerjesztett állapotokban, míg az elektronok többnyire a TDP csoportban helyezkednek el, ami a CT intramolekuláris jellemzőit mutatja.Ezenkívül ezeknél a szingulett gerjesztett állapotoknál többé-kevésbé átfedés van a lyukak és az elektronok között, ami arra utal, hogy ezek a szingulett gerjesztett állapotok hozzájárulnak a helyi gerjesztéshez (LE).A dimerek esetében az intramolekuláris CT és LE jellemzők mellett az intermolekuláris CT analízis alapján az intermolekuláris CT jellemzők bizonyos hányadát figyelték meg a megfelelő állapotokban, különösen az S3, S4, S7 és S8 állapotokban, ahol a CT intermolekuláris átmenetek voltak a főbbek. (Kiegészítő táblázat).3).
A kísérleti eredmények jobb megértése érdekében tovább vizsgáltuk a RuDA gerjesztett állapotok tulajdonságait, hogy feltárjuk a monomerek és a dimerek közötti különbségeket (4–5. kiegészítő táblázatok).A 3B. ábrán látható, hogy a dimer szingulett és triplett gerjesztett állapotának energiaszintje sokkal sűrűbb, mint a monomeré, ami segít csökkenteni az S1 és Tn közötti energiarést. Beszámoltak arról, hogy az ISC átmeneteket kis energiarésen belül (ΔES1-Tn < 0,3 eV) lehet megvalósítani S1 és Tn54 között. Beszámoltak arról, hogy az ISC átmenetek megvalósíthatók egy kis energiarésben (ΔES1-Tn < 0,3 eV) az S1 és Tn54 között. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (Δ0,1-4меской щели) Beszámoltak arról, hogy az S1 és Tn54 közötti kis energiarésben (ΔES1-Tn <0,3 eV) az ISC átmenetek megvalósíthatók.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔES01,3-4м. Beszámoltak arról, hogy az ISC átmenet megvalósítható egy kis energiarésben (ΔES1-Tn < 0,3 eV) az S1 és Tn54 között.Ezen túlmenően, csak egy orbitális, foglalt vagy nem foglalt, kell különböznie kötött szingulett és triplett állapotokban, hogy nullától eltérő SOC integrált biztosítson.Így a gerjesztési energia és az orbitális átmenet elemzése alapján az ISC átmenet összes lehetséges csatornája a 1-1.3C,D.Nevezetesen, csak egy ISC-csatorna áll rendelkezésre a monomerben, míg a dimer formának négy ISC-csatornája van, amelyek fokozhatják az ISC-átmenetet.Ezért ésszerű feltételezni, hogy minél több RuDA molekula aggregálódik, annál elérhetőbbek lesznek az ISC csatornák.Ezért a RuDA aggregátumok kétsávos elektronikus struktúrákat alkothatnak szingulett és triplett állapotban, csökkentve az S1 és a rendelkezésre álló Tn közötti energiarést, ezáltal növelve az ISC hatékonyságát az 1O2 előállításának elősegítése érdekében.
A mögöttes mechanizmus további tisztázása érdekében az arén-Ru(II) komplex (RuET) referenciavegyületét szintetizáltuk úgy, hogy két etilcsoportot két trifenil-amin-fenilcsoportra cseréltünk a RuDA-ban (4A ábra, a teljes jellemzésért lásd az ESI, 15. kiegészítést). -21 ) A donortól (dietil-amin) az akceptorig (TDF) a RuET ugyanazokkal az intramolekuláris CT jellemzőkkel rendelkezik, mint a RuDA.Ahogy az várható volt, a DMF-ben lévő RuET abszorpciós spektruma alacsony energiájú töltésátviteli sávot mutatott erős abszorpcióval a közeli infravörös tartományban, 600–1100 nm tartományban (4B. ábra).Emellett a növekvő víztartalom mellett RuET aggregáció is megfigyelhető volt, ami az abszorpciós maximum vöröseltolódásában is megmutatkozott, amit a folyékony AFM képalkotás is megerősített (kiegészítő 22. ábra).Az eredmények azt mutatják, hogy a RuET a RuDA-hoz hasonlóan intramolekuláris állapotokat tud kialakítani, és önmagukban aggregált struktúrákká épül fel.
A RuET kémiai szerkezete.B RuET abszorpciós spektruma DMF és víz különböző arányú keverékeiben.Plots C EIS Nyquist a RuDA és a RuET számára.A RuDA és RuET D fotoáram-válaszai 808 nm hullámhosszú lézersugárzás hatására.
Az ABDA fotodegradációját RuET jelenlétében 808 nm hullámhosszú lézerrel végzett besugárzással értékeltük.Meglepő módon nem figyelték meg az ABDA lebomlását a különböző vízfrakciókban (23. kiegészítő ábra).Ennek lehetséges oka, hogy a RuET nem tud hatékonyan sávos elektronszerkezetet kialakítani, mivel az etillánc nem segíti elő a hatékony intermolekuláris töltésátvitelt.Ezért elektrokémiai impedancia spektroszkópiát (EIS) és tranziens fotoáram méréseket végeztünk a RuDA és a RuET fotoelektrokémiai tulajdonságainak összehasonlítására.A Nyquist-diagram szerint (4C. ábra) a RuDA sokkal kisebb sugarat mutat, mint a RuET, ami azt jelenti, hogy a RuDA56 gyorsabb intermolekuláris elektrontranszporttal és jobb vezetőképességgel rendelkezik.Ezenkívül a RuDA fotoáram-sűrűsége sokkal nagyobb, mint a RuET-é (4D. ábra), ami megerősíti a RuDA57 jobb töltésátviteli hatékonyságát.Így az ércben lévő trifenil-amin fenilcsoportja fontos szerepet játszik az intermolekuláris töltésátvitelben és a sávos elektronszerkezet kialakításában.
A tumor felhalmozódásának és az in vivo biokompatibilitás növelése érdekében tovább kapszuláztuk a RuDA-t F127-tel.A RuDA-NP-k átlagos hidrodinamikai átmérőjét 123,1 nm-nek határoztuk meg szűk eloszlás mellett (PDI = 0,089) a dinamikus fényszórásos (DLS) módszerrel (5A ábra), amely a permeabilitás és a retenció növelésével elősegítette a tumor felhalmozódását.EPR) hatása.A TEM-képek azt mutatták, hogy az Ore NP-k egyenletes gömb alakúak, átlagosan 86 nm átmérővel.Nevezetesen, a RuDA-NP-k abszorpciós maximuma 800 nm-en jelent meg (kiegészítő 24. ábra), jelezve, hogy a RuDA-NP-k megtarthatják az önszerveződő RuDA-k funkcióit és tulajdonságait.Az NP Ore számított ROS kvantumhozama 15,9%, ami az Ore-hoz hasonlítható A RuDA NP-k fototermikus tulajdonságait 808 nm hullámhosszú lézersugárzás hatására infravörös kamerával vizsgáltuk.ábrán látható módon.Az 5B, C, a kontrollcsoport (csak PBS) enyhe hőmérséklet-emelkedést tapasztalt, míg a RuDA-NPs oldat hőmérséklete gyorsan emelkedett a hőmérséklet (ΔT) emelkedésével 15,5, 26,1 és 43,0 °C-ra.A magas koncentrációk 25, 50 és 100 µM voltak, ami a RuDA NP-k erős fototermikus hatását jelzi.Ezenkívül fűtési/hűtési ciklus méréseket végeztünk a RuDA-NP fototermikus stabilitásának értékelésére és az ICG-vel való összehasonlítására.Az érc NP-k hőmérséklete nem csökkent öt fűtési/hűtési ciklus után (5D. ábra), ami az érc NP-k kiváló fototermikus stabilitását jelzi.Ezzel szemben az ICG alacsonyabb fototermikus stabilitást mutat, amint azt a fototermikus hőmérsékleti plató látszólagos eltűnése mutatja azonos körülmények között.Az előző módszer szerint58 a RuDA-NP fototermikus konverziós hatékonyságát (PCE) 24,2%-ra számolták, ami magasabb, mint a meglévő fototermikus anyagoknál, mint például az arany nanorudak (21,0%) és az arany nanohéjak (13,0%)59.Így az NP Ore kiváló fototermikus tulajdonságokkal rendelkezik, ami ígéretes PTT ágenssé teszi őket.
A RuDA NP-k DLS és TEM képeinek elemzése (inset).B 808 nm (0,5 W cm-2) hullámhosszú lézersugárzásnak kitett RuDA NP különböző koncentrációjú hőképei.C Különböző koncentrációjú érc-NP-k fototermikus konverziós görbéi, amelyek kvantitatív adatok.B. D Az ORE NP és az ICG hőmérséklet-emelkedése 5 fűtési-hűtési ciklus alatt.
A RuDA NP-k fotocitotoxicitását MDA-MB-231 humán emlőráksejtekkel szemben in vitro értékelték.ábrán látható módon.A 6A, B, a RuDA-NP és a RuDA elhanyagolható citotoxicitást mutatott besugárzás hiányában, ami a RuDA-NP és a RuDA alacsonyabb sötét toxicitását jelenti.Azonban a 808 nm-es hullámhosszú lézersugárzásnak kitett RuDA és RuDA NP erős fotocitotoxicitást mutatott az MDA-MB-231 rákos sejtekkel szemben 5,4 és 9,4 μM IC50 értékkel (a maximális gátló koncentráció fele), ami azt bizonyítja, hogy hogy a RuDA-NP-nek és a RuDA-nak van potenciálja a rák fototerápiájában.Ezenkívül a RuDA-NP és a RuDA fotocitotoxicitását tovább vizsgálták C-vitamin (Vc) jelenlétében, amely egy ROS-megkötő, hogy tisztázzák a ROS szerepét a fény által kiváltott citotoxicitásban.Nyilvánvaló, hogy a sejtek életképessége nőtt a Vc hozzáadása után, és a RuDA és RuDA NP-k IC50 értéke 25,7, illetve 40,0 μM volt, ami bizonyítja a ROS fontos szerepét a RuDA és RuDA NP-k fotocitotoxicitásában.RuDA-NP-k és RuDA fény által indukált citotoxicitása MDA-MB-231 rákos sejtekben élő/halott sejtfestéssel calcein AM (élő sejtek zöld fluoreszcencia) és propidium-jodid (PI, vörös fluoreszcencia az elhalt sejteknél) felhasználásával.sejtekkel megerősítve) fluoreszcens próbákként.A 6C. ábrán látható, hogy a RuDA-NP-vel vagy RuDA-val kezelt sejtek besugárzás nélkül is életképesek maradtak, amit az intenzív zöld fluoreszcencia bizonyít.Éppen ellenkezőleg, lézeres besugárzásnál csak vörös fluoreszcenciát figyeltünk meg, ami megerősíti a RuDA vagy RuDA NP-k hatékony fotocitotoxicitását.Figyelemre méltó, hogy a Vc hozzáadása után zöld fluoreszcencia jelent meg, ami a RuDA és RuDA NP-k fotocitotoxicitásának megsértését jelzi.Ezek az eredmények összhangban vannak az in vitro fotocitotoxicitási tesztekkel.
Az A RuDA- és B RuDA-NP sejtek dózisfüggő életképessége MDA-MB-231 sejtekben Vc (0,5 mM) jelenlétében vagy hiányában.Hibasávok, átlag ± szórás (n = 3). Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001.C Élő/halott sejtek festési analízise kalcein AM és propidium-jodid felhasználásával fluoreszcens próbákként.Skála: 30 µm.Mindegyik csoportból három biológiai ismétlődés reprezentatív képei láthatók.D ROS termelés konfokális fluoreszcens képei MDA-MB-231 sejtekben különböző kezelési körülmények között.A zöld DCF fluoreszcencia ROS jelenlétét jelzi.Besugárzás 808 nm hullámhosszú, 0,5 W/cm2 teljesítményű lézerrel 10 percig (300 J/cm2).Skála: 30 µm.Mindegyik csoportból három biológiai ismétlődés reprezentatív képei láthatók.E Áramlási citometria RuDA-NP (50 µM) vagy RuDA (50 µM) kezelés elemzése 808 nm-es lézerrel (0,5 W cm-2) vagy anélkül Vc (0,5 mM) jelenlétében és távollétében 10 percig.Mindegyik csoportból három biológiai ismétlődés reprezentatív képei láthatók.RuDA-NP-kkel (50 µM) kezelt MDA-MB-231 sejtek F Nrf-2, HSP70 és HO-1 808 nm-es lézersugárzással vagy anélkül (0,5 W cm-2, 10 perc, 300 J cm-2), sejtek expresszálnak 2).Mindegyik csoportból két biológiai ismétlődés reprezentatív képei láthatók.
Az intracelluláris ROS termelést MDA-MB-231 sejtekben 2,7-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) festési módszerrel vizsgáltuk.ábrán látható módon.A 6D. ábrán a RuDA-NP-kkel vagy RuDA-val kezelt sejtek kifejezetten zöld fluoreszcenciát mutattak, amikor 808 nm-es lézerrel besugározták, ami azt jelzi, hogy a RuDA-NP-k és a RuDA hatékonyan képesek ROS-t generálni.Ezzel szemben fény hiányában vagy Vc jelenlétében csak gyenge fluoreszcens jelet figyeltünk meg a sejtekben, ami enyhe ROS képződést jelez.Az intracelluláris ROS szinteket a RuDA-NP sejtekben és a RuDA-val kezelt MDA-MB-231 sejtekben tovább határoztuk meg áramlási citometriával.Amint az a 25. kiegészítő ábrán látható, a RuDA-NP és RuDA által 808 nm-es lézeres besugárzás mellett generált átlagos fluoreszcencia intenzitás (MFI) szignifikánsan, körülbelül 5,1-szeresére, illetve 4,8-szorosára nőtt a kontrollcsoporthoz képest, megerősítve a kiváló AFK képződést.kapacitás.Azonban a RuDA-val kezelt RuDA-NP vagy MDA-MB-231 sejtekben az intracelluláris ROS szint csak a lézeres besugárzás nélküli vagy Vc jelenlétében végzett kontrollokhoz volt hasonló, hasonlóan a konfokális fluoreszcencia analízis eredményeihez.
Kimutatták, hogy a mitokondriumok a Ru(II)-arén komplexek fő célpontjai60.Ezért a RuDA és a RuDA-NP-k szubcelluláris lokalizációját vizsgáltuk.Amint az a 26. kiegészítő ábrán látható, a RuDA és a RuDA-NP hasonló sejteloszlási profilokat mutat, a legmagasabb akkumulációval a mitokondriumokban (62,5 ± 4,3 és 60,4 ± 3,6 ng/mg fehérje).Az Ore és az NP Ore nukleáris frakcióiban azonban csak kis mennyiségű Ru található (3,5 és 2,1%).A fennmaradó sejtfrakció maradék ruténiumot tartalmazott: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg fehérje) a RuDA és 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg fehérje) a RuDA-NP-k esetében.Általában az érc és az NP Ore főként a mitokondriumokban halmozódik fel.A mitokondriális diszfunkció felmérésére JC-1 és MitoSOX Red festést alkalmaztunk a mitokondriális membránpotenciál és a szuperoxid termelési kapacitás felmérésére.Amint az a 27. kiegészítő ábrán látható, intenzív zöld (JC-1) és vörös (MitoSOX Red) fluoreszcenciát figyeltek meg a RuDA-val és RuDA-NP-kkel egyaránt kezelt sejtekben 808 nm-es lézersugárzás mellett, ami azt jelzi, hogy mind a RuDA, mind a RuDA-NP erősen fluoreszkál. Hatékonyan indukálhatja a mitokondriális membrán depolarizációját és szuperoxid képződését.Ezenkívül meghatároztuk a sejthalál mechanizmusát annexin V-FITC/propidium-jodid (PI) áramlási citometrián alapuló analízisével.A 6E. ábrán látható, hogy 808 nm-es lézerrel besugározva a RuDA és a RuDA-NP szignifikánsan megnövekedett korai apoptózis arányt (jobb alsó negyed) indukált MDA-MB-231 sejtekben a PBS vagy PBS plusz lézerhez képest.feldolgozott sejteket.A Vc hozzáadásával azonban a RuDA és a RuDA-NP apoptózisának aránya szignifikánsan, 50,9%-ról 52,0%-ról 15,8%-ra, illetve 17,8%-ra csökkent, ami megerősíti a ROS fontos szerepét a RuDA és a RuDA-NP fotocitotoxicitásában..Ezenkívül enyhe nekrotikus sejteket figyeltek meg minden vizsgált csoportban (bal felső negyed), ami arra utal, hogy az apoptózis lehet a RuDA és RuDA-NP-k által kiváltott sejthalál domináns formája.
Mivel az oxidatív stressz károsodás az apoptózis fő meghatározója, az eritroid 2-vel, a 2-es faktorral (Nrf2) 62, az antioxidáns rendszer kulcsfontosságú szabályozójával kapcsolatos nukleáris faktort vizsgálták RuDA-NP-vel kezelt MDA-MB-231-ben.A besugárzás által kiváltott RuDA NP-k hatásmechanizmusa.Ugyanakkor a downstream protein hem oxigenáz 1 (HO-1) expresszióját is kimutattuk.Amint az a 6F ábrán és a 29. kiegészítő ábrán látható, a RuDA-NP által közvetített fototerápia növelte az Nrf2 és HO-1 expressziós szintet a PBS csoporthoz képest, jelezve, hogy a RuDA-NP-k stimulálhatják az oxidatív stressz jelátviteli útvonalakat.Ezen túlmenően a RuDA-NPs63 fototermikus hatásának tanulmányozásához a Hsp70 hősokk-fehérje expresszióját is értékelték.Nyilvánvaló, hogy a RuDA-NP-kkel + 808 nm-es lézersugárzással kezelt sejtek fokozott Hsp70 expressziót mutattak a másik két csoporthoz képest, ami a hipertermiára adott sejtes választ tükrözi.
A figyelemre méltó in vitro eredmények arra késztettek bennünket, hogy megvizsgáljuk a RuDA-NP in vivo teljesítményét MDA-MB-231 daganatos nude egereken.A RuDA NP-k szöveti eloszlását a máj, a szív, a lép, a vesék, a tüdő és a daganatok ruténiumtartalmának meghatározásával tanulmányozták.ábrán látható módon.A 7A. ábrán látható, hogy az érc NP-k maximális tartalma a normál szervekben az első megfigyelési időpontban (4 óra), míg a tumorszövetekben a maximális tartalmat az injekció után 8 órával határozták meg, valószínűleg az érc NP-k miatt.Az LF EPR hatása.Az eloszlási eredmények szerint az NP-érces kezelés optimális időtartamát a beadás után 8 órával határoztuk meg.A RuDA-NP-k daganatos helyeken történő felhalmozódási folyamatának szemléltetésére a RuDA-NP-k fotoakusztikus (PA) tulajdonságait a RuDA-NP-k PA-jeleinek az injekció után különböző időpontokban történő rögzítésével figyeltük.Először is, a RuDA-NP PA-jelét in vivo értékeltük úgy, hogy a RuDA-NP intratumorális injekciója után PA-képeket rögzítettünk egy tumor helyéről.Amint az a 30. kiegészítő ábrán látható, a RuDA-NP-k erős PA jelet mutattak, és pozitív korreláció volt a RuDA-NP koncentrációja és a PA jel intenzitása között (30A. kiegészítő ábra).Ezután in vivo PA képeket rögzítettünk a tumor helyeiről a RuDA és a RuDA-NP intravénás injekciója után az injekció beadása után különböző időpontokban.Amint az a 7B. ábrán látható, a daganat helyéről származó RuDA-NP-k PA jele az idő múlásával fokozatosan növekedett, és az injekció beadása után 8 órával elérte a platót, összhangban az ICP-MS analízissel meghatározott szöveti eloszlási eredményekkel.Ami a RuDA-t illeti (kiegészítő 30B. ábra), a PA-jel maximális intenzitása 4 órával az injekció beadása után jelent meg, ami azt jelzi, hogy a RuDA gyorsan behatol a daganatba.Ezen túlmenően a RuDA és a RuDA-NP-k kiválasztási viselkedését vizsgáltuk a vizeletben és a székletben lévő ruténium mennyiségének ICP-MS segítségével történő meghatározásával.A RuDA (kiegészítő 31. ábra) és a RuDA-NP-k (7C. ábra) kiürülésének fő útvonala a széklettel történik, és a RuDA és RuDA-NP-k hatékony kiürülését figyelték meg a 8 napos vizsgálati időszak alatt, ami azt jelenti, hogy a RuDA és a RuDA-NP-k hatékonyan ürülhetnek ki a szervezetből hosszú távú toxicitás nélkül.
A. A RuDA-NP ex vivo eloszlását egér szövetekben a Ru-tartalom (a beadott Ru (ID) dózis százaléka szövet grammonként) alapján határoztuk meg az injekciót követő különböző időpontokban.Az adatok átlag ± szórás (n = 3). Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001.B PA képek in vivo tumorhelyekről 808 nm-es gerjesztésnél RuDA-NP-k (10 µmol kg-1) intravénás beadása után különböző időpontokban.RuDA NP-k (10 µmol kg-1) intravénás beadása után a C Ru különböző időközönként vizelettel és széklettel ürült ki az egerekből.Az adatok átlag ± szórás (n = 3).
A RuDA-NP in vivo fűtőkapacitását MDA-MB-231 és RuDA daganatos nude egereken vizsgáltuk összehasonlítás céljából.ábrán látható módon.A 8A. ábrán és a kiegészítő 32. ábrán a kontroll (sóoldat) csoport kisebb hőmérsékletváltozást mutatott (ΔT ≈ 3 °C) 10 perces folyamatos expozíció után.A RuDA-NP és a RuDA hőmérséklete azonban gyorsan emelkedett, 55, 2 és 49, 9 ° C-os maximális hőmérséklettel, amely elegendő hipertermiát biztosít az in vivo rákterápiához.A RuDA NP-k esetében megfigyelt magas hőmérséklet-emelkedés (ΔT ≈ 24 °C) a RuDA-hoz képest (ΔT ≈ 19 °C) a jobb permeabilitásának és az EPR-hatás miatti tumorszövetekben való felhalmozódásának tudható be.
MDA-MB-231 daganatos egerek infravörös hőképei 808 nm-es lézerrel besugározva különböző időpontokban 8 órával az injekció beadása után.Mindegyik csoportból négy biológiai ismétlődés reprezentatív képei láthatók.B Relatív tumortérfogat és C A különböző egércsoportok átlagos daganattömege a kezelés során.D Különböző egércsoportok testtömegének görbéi.Besugárzás 808 nm hullámhosszú, 0,5 W/cm2 teljesítményű lézerrel 10 percig (300 J/cm2).Hibasávok, átlag ± szórás (n = 3). Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Páratlan, kétoldalas t tesztek *p < 0,05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001. Páratlan kétvégű t-próbák *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001. E H&E festési képek a főbb szervekről és daganatokról különböző kezelési csoportokból, beleértve a sóoldat, sóoldat + lézer, RuDA, RuDA + lézer, RuDA-NP és RuDA-NP + lézer csoportokat. E H&E festési képek a főbb szervekről és daganatokról különböző kezelési csoportokból, beleértve a sóoldat, sóoldat + lézer, RuDA, RuDA + lézer, RuDA-NP és RuDA-NP + lézer csoportokat. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E festési képek főbb szervekről és daganatokról különböző kezelési csoportokból, beleértve a sóoldat, sóoldat + lézer, RuDA, RuDA + lézer, RuDA-NP és RuDA-NP + lézer csoportokat.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 的 E H & E 染色 ， ， 包括 、 盐 水 水 + 激光 、 ruda 、 ruda + 激光 、 、 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。。。。。。。。。。。。。。。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Főbb szervek és daganatok E H&E festése különböző kezelési csoportokból, beleértve a sóoldat, sóoldat + lézer, RuDA, RuDA + lézer, RuDA-NP és RuDA-NP + lézer.Skála: 60 µm.
A RuDA és RuDA NP-kkel végzett fototerápia in vivo hatását értékelték, amelyben MDA-MB-231 daganatos meztelen egereket intravénásan injekcióztak RuDA vagy RuDA NP-kkel egyszeri 10,0 µmol kg-1 dózisban a farokvénán keresztül, majd 8 órával az injekció beadása után.lézeres besugárzás 808 nm hullámhosszon.Amint a 8B. ábrán látható, a tumor térfogata szignifikánsan megnövekedett a sóoldattal és a lézerrel kezelt csoportokban, ami azt jelzi, hogy a sóoldat vagy a lézer 808 besugárzás csekély hatással volt a daganat növekedésére.A sóoldattal kezelt csoporthoz hasonlóan a RuDA-NP-vel vagy RuDA-val kezelt egerekben is megfigyelték a gyors daganatnövekedést lézeres besugárzás nélkül, ami bizonyítja alacsony sötét toxicitásukat.Ezzel szemben a lézeres besugárzást követően mind a RuDA-NP, mind a RuDA kezelés szignifikáns tumorregressziót indukált, 95,2%-os, illetve 84,3%-os tumortérfogat-csökkenéssel a sóoldattal kezelt csoporthoz képest, ami kiváló szinergikus PDT-re utal., amit a RuDA/CHTV effektus közvetít.– NP vagy Ore A RuDA-val összehasonlítva a RuDA NP-k jobb fototerápiás hatást mutattak, ami elsősorban a RuDA NP-k EPR hatásának volt köszönhető.A tumornövekedés-gátlás eredményeit tovább értékeltük a kezelés 15. napján kimetszett daganat tömegével (8C. ábra és 33. kiegészítő ábra).Az átlagos tumortömeg a RuDA-NP-vel kezelt egerekben, illetve a RuDA-val kezelt egerekben 0,08, illetve 0,27 g volt, ami sokkal könnyebb volt, mint a kontrollcsoportban (1,43 g).
Ezenkívül az egerek testtömegét háromnaponta feljegyeztük, hogy tanulmányozzuk a RuDA-NP-k vagy a RuDA sötét toxicitását in vivo.Amint a 8D. ábrán látható, nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a testtömegben az egyik kezelési csoportban sem. Ezenkívül elvégeztük a főbb szervek (szív, máj, lép, tüdő és vese) hematoxilin és eozin (H&E) festését különböző kezelési csoportokból. Továbbá elvégeztük a főbb szervek (szív, máj, lép, tüdő és vese) hematoxilin és eozin (H&E) festését különböző kezelési csoportokból. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (ser. Ezenkívül a különböző kezelési csoportokból származó főbb szervek (szív, máj, lép, tüdő és vesék) hematoxilin és eozin (H&E) festését végezték el.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏、肺和肾脏）肺和肾脏）进衼组的主要器官 (Ő) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Ezenkívül a főbb szervek (szív, máj, lép, tüdő és vese) hematoxilin és eozin (H&E) festését végezték el a különböző kezelési csoportokban.ábrán látható módon.A 8E. ábrán látható, hogy a RuDA-NP és a RuDA csoport öt fő szervének H&E festési képei nem mutatnak nyilvánvaló rendellenességeket vagy szervkárosodásokat. A 8E. ábrán látható, hogy a RuDA-NP és a RuDA csoport öt fő szervének H&E festési képei nem mutatnak nyilvánvaló rendellenességeket vagy szervkárosodásokat.ábrán látható módon.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируют явных ановных явных аномали демонстрируют явных аномали. A 8E, a RuDA-NP és a RuDA csoport öt fő szervének H&E festési képei nem mutatnak nyilvánvaló szervi rendellenességeket vagy elváltozásokat.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显玤如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8E, изображения окрашивания изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп групп RuDA-орнорноваленижапнормолреия не показазания Amint a 8E. ábrán látható, a RuDA-NP és a RuDA csoport öt fő szervének H&E festési képei nem mutattak nyilvánvaló rendellenességeket vagy szervkárosodást.Ezek az eredmények azt mutatták, hogy sem a RuDA-NP, sem a RuDA nem mutatott toxicitás jeleit in vivo. Ezenkívül a daganatok H&E festési képei azt mutatták, hogy mind a RuDA + Laser, mind a RuDA-NPs + Laser csoport súlyos rákos sejtpusztulást okozhat, bizonyítva a RuDA és a RuDA-NP kiváló in vivo fototerápiás hatékonyságát. Ezenkívül a daganatok H&E festési képei azt mutatták, hogy mind a RuDA + Laser, mind a RuDA-NPs + Laser csoport súlyos rákos sejtpusztulást okozhat, bizonyítva a RuDA és a RuDA-NP kiváló in vivo fototerápiás hatékonyságát.Ezenkívül a hematoxilin-eozinnal festett tumorképek azt mutatták, hogy mind a RuDA+Laser, mind a RuDA-NPs+Laser csoportok súlyos rákos sejtek pusztulását idézhetik elő, bizonyítva a RuDA és RuDA-NP-k kiváló fototerápiás hatékonyságát in vivo.此外 ， 肿瘤 的 的 H & E 染色 图像 显示 ， ruda + lézer 和 ruda-nps + lézer 组均 导致 导致 严重 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 的 体内 光疗 功效 功效。。 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗此外 ， 肿瘤 的 的 & e 染色 ， ， ruda + lézer 和 ruda-nps + lézer 组均 导致 的 癌 细胞 ， ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗..Ezenkívül a hematoxilinnel és eozinnal festett tumorképek azt mutatták, hogy mind a RuDA+Laser, mind a RuDA-NPs+Laser csoport a rákos sejtek súlyos pusztulását eredményezte, ami a RuDA és RuDA-NP kiváló fototerápiás hatékonyságát mutatja in vivo.
Összefoglalva, a Ru(II)-arén (RuDA) fémorganikus komplexet DA-típusú ligandumokkal úgy tervezték, hogy megkönnyítsék az ISC folyamatot aggregációs módszerrel.A szintetizált RuDA nem kovalens kölcsönhatások révén képes önállóan összeállni, hogy RuDA-eredetű szupramolekuláris rendszereket hozzon létre, ezáltal megkönnyítve az 1O2 képződést és a hatékony fototermikus konverziót a fény által kiváltott rákterápiában.Figyelemre méltó, hogy a monomer RuDA nem generált 1O2-t lézeres besugárzás hatására 808 nm-en, de nagy mennyiségű 1O2-t tudott generálni aggregált állapotban, bizonyítva tervezésünk racionalitását és hatékonyságát.A későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy a szupramolekuláris összeállítás javított fotofizikai és fotokémiai tulajdonságokkal ruházza fel a RuDA-t, mint például a vöröseltolódási abszorpció és a fényfehérítés ellenállása, amelyek nagyon kívánatosak a PDT és PTT feldolgozáshoz.Mind in vitro, mind in vivo kísérletek kimutatták, hogy a jó biokompatibilitással és a tumorban jól felhalmozódó RuDA NP-k kiváló fényindukált rákellenes aktivitást mutatnak 808 nm hullámhosszú lézeres besugárzással.Így a RuDA NP-k, mint hatékony bimodális szupramolekuláris PDT/PTW reagensek, gazdagítják a 800 nm feletti hullámhosszon aktivált fotoszenzibilizátorok készletét.A szupramolekuláris rendszer elvi felépítése hatékony útvonalat biztosít a NIR-aktivált fényérzékenyítők számára, kiváló fényérzékenyítő hatással.
Az összes vegyszert és oldószert kereskedelmi beszállítóktól szereztük be, és további tisztítás nélkül használtuk fel.A RuCl3-at a Boren Precious Metals Co., Ltd.-től (Kunming, Kína) vásároltuk.[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) és 4,7-bisz[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 A ,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolt korábbi tanulmányok szerint szintetizálták64,65.Az NMR-spektrumokat Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrométeren vettük fel a Southeastern University Analytical Test Centerben, oldószerként d6-DMSO-t vagy CDCl3-at használva.A δ kémiai eltolódásokat ppm-ben adjuk meg.a tetrametil-szilánra vonatkoztatva, és a J kölcsönhatási állandók abszolút értékben vannak megadva hertzben.A nagyfelbontású tömegspektrometriát (HRMS) Agilent 6224 ESI/TOF MS készüléken végeztük.A C, H és N elemanalízisét Vario MICROCHNOS elemanalizátoron (Elementar) végeztük.Az UV-látható spektrumokat Shimadzu UV3600 spektrofotométeren mértük.A fluoreszcencia spektrumokat Shimadzu RF-6000 spektrofluoriméterrel vettük fel.Az EPR spektrumokat Bruker EMXmicro-6/1 készüléken vettük fel.Az elkészített minták morfológiáját és szerkezetét 200 kV-os feszültségen működő FEI Tecnai G20 (TEM) és Bruker Icon (AFM) műszerekkel vizsgáltuk.A dinamikus fényszórást (DLS) Nanobrook Omni analizátoron (Brookhaven) végeztük.A fotoelektrokémiai tulajdonságokat elektrokémiai berendezésen (CHI-660, Kína) mértük.A fotoakusztikus képeket a FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR rendszerrel készítettük.A konfokális képeket Olympus FV3000 konfokális mikroszkóppal készítettük.A FACS analízist BD Calibur áramlási citométerrel végeztük.A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) kísérleteket Waters Alliance e2695 rendszeren, 2489 UV/Vis detektorral végeztük.A gélpermeációs kromatográfiás (GPC) teszteket Thermo ULTIMATE 3000 műszerrel rögzítettük ERC RefratoMax520 törésmutató detektor segítségével.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bisz[4-(N, N-difenil-amino)-fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) és jégecet (30 ml) 12 órán át keverjük visszafolyató hűtő alatt.Az oldószert ezután vákuumban rotációs bepárló segítségével eltávolítjuk.A kapott maradékot flash-oszlopkromatográfiával (szilikagél, CH2CI2:MeOH=20:1) tisztítottuk, így RuDA-t kaptunk zöld por formájában (kitermelés: 877,5 mg, 80%).végbélnyílás.Számított C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.mért: C: 67,92, H: 4,26, N: 9,82.1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO) 8 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (ppm) 158,03, 152.81, 149,31, 147,98, 147,16, 139.98, 136,21, 135,57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128,01, 125,51, 12,45, 125,45, 125,45. , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 1097,25.
4,7-bisz[4-(N,N-dietil-amino)-fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2) szintézise: Az L2-t két lépésben állítottuk elő.Pd(PPh3)4-et (46 mg, 0,040 mmol) adtunk N,N-dietil-4-(tributilsztannil)anilinhez (1,05 g, 2,4 mmol) és 4,7-dibróm-5,6-dinitro-oldathoz - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) 100 ml vízmentes toluolban.Az elegyet 100 °C-on 24 órán át keverjük.A toluolt vákuumban eltávolítjuk, majd a kapott szilárd anyagot petroléterrel mossuk.Ezután e vegyület (234,0 mg, 0,45 mmol) és vaspor (0,30 g, 5,4 mmol) 20 ml ecetsavban készült elegyét 80 °C-on 4 órán át keverjük.A reakcióelegyet vízbe öntjük, és a kapott barna szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük.A terméket kétszer vákuum-szublimációval tisztítva zöld szilárd anyagot kapunk (126,2 mg, 57%-os hozam).végbélnyílás.Számított C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.mért: C: 67,84, H: 6,95, H: 18,16.1H-NMR (600 MHz, CDC13), 8 (ppm): 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C-NMR (150 MHz, CDC13), 8 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+=461,24.
A vegyületeket a RuDA-hoz hasonló eljárásokkal állítottuk elő és tisztítottuk.végbélnyílás.Számított C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.talált: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81,1H-NMR (600 MHz, d6-DMSO), 8 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134.71, 130.44, 128,87, 128.35, 121,70, 111,84, 110,76, 105.07., 38,06, 31,22, 29,69, 22,29, 19,19, 14,98, 12,93.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 905,24.
A RuDA-t MeOH/H2O (5/95, v/v) elegyben oldottuk fel 10 μM koncentrációban.A RuDA abszorpciós spektrumát 5 percenként mértük Shimadzu UV-3600 spektrofotométeren 808 nm (0,5 W/cm2) hullámhosszú lézerfénnyel történő besugárzás mellett.Az ICG spektrumokat ugyanolyan körülmények között vettük fel, mint a standardot.
Az EPR spektrumokat Bruker EMXmicro-6/1 spektrométeren vettük fel 20 mW mikrohullámú teljesítményű, 100 G pásztázási tartományú és 1 G térmodulációval. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidon (TEMP) és 5,5-dimetil-1-pirrolin-N-oxidot (DMPO) használtunk spincsapdákként.Az elektronspin rezonancia spektrumokat RuDA (50 µM) és TEMF (20 mM) vagy DMPO (20 mM) vegyes oldataira vettük fel 808 nm (0,5 W/cm2) hullámhosszú lézersugárzás hatására.
A RuDA DFT és TD-DFT számításait PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ szinten végeztük vizes oldatban a Gaussian program 1666,67,68 segítségével.Az alacsony energiájú szingulett gerjesztett állapotú RuDA HOMO-LUMO, lyuk- és elektroneloszlását a GaussView programmal (5.0-s verzió) ábrázoltuk.
Először a hagyományos UV-látható spektroszkópiával, ICG-vel (ΦΔ = 0,002) próbáltuk mérni az 1O2 RuDA generálási hatékonyságát, de az ICG fotodegradációja erősen befolyásolta az eredményeket.Így az 1O2 RuDA kvantumhozamát úgy mértük, hogy az ABDA fluoreszcencia intenzitásában bekövetkezett változást detektáltuk körülbelül 428 nm-en 808 nm (0,5 W/cm2) hullámhosszú lézerrel besugározva.A kísérleteket RuDA és RuDA NP-ken (20 μM) végeztük víz/DMF (98/2, v/v) oldatban, amely ABDA-t (50 μM) tartalmazott.Az 1O2 kvantumhozamát a következő képlet alapján számítottuk ki: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).Az rPS és az rICG az ABDA és az 1O2 reakciósebességei, amelyeket a fotoszenzibilizátorból, illetve az ICG-ből kapunk.Az APS és az AICG a fényérzékenyítő és az ICG abszorbanciája 808 nm-en.
Az AFM méréseket folyékony körülmények között, a Bruker Dimension Icon AFM rendszer pásztázó üzemmódjával végeztük.Folyékony sejtekkel nyitott szerkezetet használva a sejteket kétszer mostuk etanollal, és nitrogénárammal szárítottuk.Helyezze be a szárított sejteket a mikroszkóp optikai fejébe.Azonnal helyezzen egy csepp mintát a folyadékmedencébe, és helyezze a konzolra egy steril eldobható műanyag fecskendő és egy steril tű segítségével.Egy másik cseppet közvetlenül a mintára helyeznek, és amikor az optikai fejet leengedik, a két csepp összeolvad, meniszkuszt képezve a minta és a folyadéktartály között.Az AFM méréseket SCANASYST-FLUID V alakú nitrid konzollal (Bruker, keménység k = 0,7 N m-1, f0 = 120-180 kHz) végeztem.
A HPLC kromatogramokat egy Phoenix C18 oszloppal (250×4,6 mm, 5 µm) felszerelt Waters e2695 rendszeren vettük fel, 2489 UV/Vis detektort használva.A detektor hullámhossza 650 nm.Az A és B mozgófázis víz és metanol volt, a mozgófázis áramlási sebessége 1,0 ml·perc-1.A gradiens (B oldószer) a következő volt: 100% 0-4 perc, 100%-50% 5-30 perc, és visszaállítás 100%-ra 31-40 perc között.Az ércet metanol és víz (50/50 térfogatarányú) vegyes oldatában 50 μM koncentrációban oldottuk fel.Az injekció térfogata 20 μl volt.
A GPC vizsgálatokat két PL aquagel-OH MIXED-H oszloppal (2×300×7,5 mm, 8 µm) és egy ERC RefratoMax520 törésmutató detektorral felszerelt Thermo ULTIMATE 3000 műszeren rögzítettük.A GPC oszlopot vízzel 1 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk 30 °C-on.Az érc-NP-ket PBS-oldatban (pH = 7,4, 50 μM) oldottuk, az injektált térfogat 20 μL volt.
A fotoáramokat elektrokémiai berendezésen (CHI-660B, Kína) mértük.Az optoelektronikai válaszokat a lézer be- és kikapcsolásakor (808 nm, 0,5 W/cm2) 0,5 V feszültségen mérték egy fekete dobozban.Szabványos háromelektródos cellát használtunk egy L-alakú üveges szénelektródával (GCE) munkaelektródaként, egy standard kalomelelektródával (SCE) referenciaelektródaként és egy platinalemezzel ellenelektródaként.Elektrolitként 0,1 M Na2SO4 oldatot használtunk.
Az MDA-MB-231 humán mellrák sejtvonalat a KeyGEN Biotec Co., LTD-től (Nanjing, Kína, katalógusszám: KG033) vásároltuk.A sejteket egyrétegű rétegekben növesztettük Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, magas glükóz) táptalajban, amelyet 10%-os magzati borjúszérum (FBS), penicillin (100 μg/ml) és sztreptomicin (100 μg/ml) oldatával egészítettünk ki.Minden sejtet 37 °C-on tenyésztettünk 5% CO2-ot tartalmazó nedves atmoszférában.
Az MTT vizsgálatot a RuDA és a RuDA-NP citotoxicitásának meghatározására használtuk fénybesugárzás jelenlétében és hiányában, Vc-vel (0,5 mM) vagy anélkül.MDA-MB-231 rákos sejteket tenyésztettünk 96 lyukú lemezeken körülbelül 1 x 105 sejt/ml/lyuk sejtsűrűséggel, és 12 órán át 37,0 °C-on inkubáltuk 5% CO2 és 95% levegő atmoszférájában.Vízben oldott RuDA és RuDA NP-ket adtunk a sejtekhez.12 órás inkubáció után a sejteket 0,5 W cm-2 lézersugárzásnak tesszük ki 808 nm hullámhosszon 10 percig (300 J cm-2), majd 24 órán át sötétben inkubáljuk.A sejteket ezután MTT-vel (5 mg/ml) további 5 órán át inkubáltuk.Végül cserélje ki a tápközeget DMSO-ra (200 µl), hogy feloldja a kapott lila formázán kristályokat.Az OD értékeket 570/630 nm hullámhosszú mikrolemez-leolvasóval mértük.Az egyes minták IC50-értékét az SPSS szoftverrel számítottuk ki legalább három független kísérletből nyert dózis-válasz görbékből.
Az MDA-MB-231 sejteket RuDA-val és RuDA-NP-vel kezeltük 50 μM koncentrációban.12 órás inkubálás után a sejteket 808 nm hullámhosszú és 0,5 W/cm2 teljesítményű lézerrel sugároztuk be 10 percig (300 J/cm2).A C-vitamin (Vc) csoportban a sejteket 0,5 mM Vc-vel kezeltük a lézeres besugárzás előtt.Ezután a sejteket további 24 órán át sötétben inkubáltuk, majd calcein AM-mel és propidium-jodiddal (20 μg/ml, 5 μl) festettük 30 percig, majd PBS-sel (10 μl, pH 7,4) mostuk.festett sejtek képei.