hírek

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
Az aktivált észtereken vagy fenoxigyökökön alapuló enzimatikus proximity jelölési módszereket széles körben alkalmazzák élő sejtekben lévő szubcelluláris proteomok és fehérje kölcsönhatások feltérképezésére.Az aktivált észterek azonban kevésbé reaktívak, ami széles jelölési sugarat eredményez, és a peroxidos kezelés során keletkező fenoxi gyökök zavarhatják a redox útvonalakat.Itt egy proximity labeling dependent photoactivation (PDPL) módszerről számolunk be, amelyet úgy fejlesztettek ki, hogy a miniSOG fotoszenzibilizáló fehérjét genetikailag összekapcsolták egy érdekes fehérjével.A kék fénnyel kiváltott és az expozíciós idő által szabályozott szingulett oxigén keletkezik, majd az anilinszonda eléri a hisztidin-maradékok térben és időben felbontott jelölését.Nagy pontosságát organellum-specifikus proteomtérképezéssel demonstráljuk.A PDPL és a TurboID egymás melletti összehasonlítása a PDPL specifikusabb és átfogóbb proteomikai lefedettségét mutatja.Ezt követően PDPL-t alkalmaztunk a BRD4 és E3 Parkin ligáz betegséggel összefüggő transzkripciós koaktivátorra, és korábban ismeretlen kölcsönhatásokat találtunk.A túlzott expressziós szűréssel két ismeretlen szubsztrátot, az Ssu72-t és az SNW1-et azonosították a Parkin esetében, amelyek lebomlását az ubikvitináció-proteaszóma útvonal közvetíti.
A fehérjehálózatok pontos jellemzése számos alapvető sejtfolyamat hátterében áll.Ezért a fehérjekölcsönhatások rendkívül pontos spatiotemporális feltérképezése molekuláris alapot biztosít a biológiai utak, a betegségek patológiájának megfejtéséhez és ezen kölcsönhatások terápiás célú megzavarásához.Ebből a célból nagyon kívánatosak olyan módszerek, amelyek képesek élő sejtekben vagy szövetekben időbeli kölcsönhatások kimutatására.Az affinitástisztítási tömegspektrometriát (AP-MS) történelmileg használták az érdeklődésre számot tartó fehérjék (POI) kötőpartnereinek azonosítására.A kvantitatív proteomikai módszerek fejlesztésével létrejött a Bioplex3.0, a legnagyobb AP-MS alapú fehérjehálózatok adatbázisa.Bár az AP-MS nagyon erős, a munkafolyamatban a sejtlízis és a hígítás lépései a gyenge és átmeneti kötési kölcsönhatások felé hajlanak, és lízis utáni műtermékeket vezetnek be, például hamis interakciós párokat, amelyek a lízis előtt nem kompartmentálódnak.
E problémák megoldására térhálósító csoportokkal rendelkező nem természetes aminosavakat (UAA) és enzimatikus közeli címkéző (PL) platformokat (pl. APEX és BioID)5 fejlesztettek ki.Bár az UAA-módszert számos forgatókönyvben sikeresen alkalmazták, és a közvetlen fehérjeragasztókról is ad tájékoztatást, az UAA beillesztési helyének optimalizálására továbbra is szükség van.Ennél is fontosabb, hogy ez egy sztöchiometrikus jelölési módszer, amelyből hiányzik a címkézési események katalitikus megfordítása.Ezzel szemben az enzimatikus PL-módszerek, például a BioID-módszer, a módosított biotin-ligázt POI7-hez fuzionálják, amely ezt követően aktiválja a biotint, és egy reaktív biotinil-AMP-észter köztiterméket képez.Az enzim így katalizál és felszabadít egy aktivált biotin „felhőt”, amely megjelöli a proximális lizin maradékokat.A BioID-nek azonban több mint 12 órára van szüksége ahhoz, hogy elegendő jelzett jelet kapjon, ami kizárja az időbeli felbontással történő használatát.Az élesztőkijelzésen alapuló irányított evolúció segítségével a TurboID-t a BioID alapján úgy tervezték meg, hogy hatékonyabb legyen, lehetővé téve a biotinnal történő hatékony címkézést 10 percen belül, lehetővé téve a dinamikusabb folyamatok tanulmányozását.Mivel a TurboID rendkívül aktív, és az endogén biotinszintek elegendőek az alacsony szintű jelöléshez, a háttérjelölés potenciális problémát jelent, amikor az exogén biotin hozzáadásával fokozott és időzített jelölésre van szükség.Ezenkívül az aktivált észterek gyengén reaktívak (t1/2 ~ 5 perc), ami nagy jelölési sugárhoz vezethet, különösen a szomszédos fehérjék biotinnal 5-tel való telítése után. Egy másik megközelítés szerint a módosított aszkorbát-peroxidáz (azaz biotin-peroxidáz) genetikai fúziója. fenolgyököket, és lehetővé teszi a fehérje jelölését egy percen belül9, 10. Az APEX-et széles körben használják szubcelluláris proteomok, membránfehérje komplexek és citoszolikus jelátviteli fehérje komplexek azonosítására11, 12. A peroxidok nagy koncentrációjának szükségessége azonban hatással lehet a redox fehérjékre vagy az útvonalakra, megzavarva sejtes folyamatok.
Így egy új módszer, amely képes nagyobb térbeli és időbeli pontossággal reaktívabb jelölt sugárelnyomó fajokat generálni anélkül, hogy jelentősen megzavarná a sejtpályákat, fontos kiegészítése lesz a meglévő módszereknek. A reaktív fajok közül a szingulett oxigén rövid élettartama és korlátozott diffúziós sugara miatt (sejtekben t1/2 < 0,6 µs) keltette fel figyelmünket13. A reaktív fajok közül a szingulett oxigén rövid élettartama és korlátozott diffúziós sugara miatt (sejtekben t1/2 < 0,6 µs) keltette fel figyelmünket13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и орморм 3. Az aktív formák közül a szingulett oxigén hívta fel figyelmünket rövid élettartama és korlátozott diffúziós sugara miatt (sejtekben t1/2 < 0,6 µs)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2枢中t1/2 < 0,6 µs， 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого 2.2. Az aktív formák közül a szingulett oxigén rövid élettartama és korlátozott diffúziós sugara (sejtekben t1/2 < 0,6 μs) miatt hívja fel figyelmünket.A szingulett oxigénről beszámoltak arról, hogy véletlenszerűen oxidálja a metionint, a tirozint, a hisztidint és a triptofánt, így 14,15 polárissá teszi az amin- vagy tiolalapú szondákhoz való kapcsolódást16,17.Bár szingulett oxigént használnak a szubcelluláris kompartment RNS jelölésére, az endogén POI-proximity markerek újrahasznosítási stratégiái továbbra is feltáratlanok.Itt bemutatjuk a fotoaktivációtól függő közelségi címkézés (PDPL) nevű platformot, ahol kék fénnyel világítjuk meg a miniSOG fényérzékenyítővel fuzionált POI-kat, és szingulett oxigéntermelést indítunk el a proximális maradékok oxidálására, majd amintartalmú módosításokkal oxidáljuk a kémiai szondákat köztes élő sejtek..Kémiai szondák egy csoportját teszteltük a címkespecifitás maximalizálása érdekében, és nyílt proteomikai munkafolyamat segítségével azonosítottuk a módosítási helyeket.A PDPL és a TurboID egymás melletti összehasonlítása a PDPL specifikusabb és átfogóbb proteomikai lefedettségét mutatja.Ezt a megközelítést alkalmaztuk a szubcelluláris proteom organellum-specifikus markereire és a BRD4 rákkal kapcsolatos epigenetikus szabályozó fehérje és a Parkinson-kórral összefüggő E3 ligáz Parkin kötőpartnereinek általános proteom azonosítására, amelyek egy ismert és egy ismeretlen fehérjehálózatot is megerősítettek. interakciók..A PDPL azon képessége, hogy felismerje az E3 szubsztrátokat nagy fehérjekomplexekben, olyan helyzetet jelent, amikor szükség van a közvetett kötőanyagok felismerésére.Két ismeretlen parkin szubsztrát ubiquitination-proteaszóma által közvetített in situ megerősítést nyert.
A fotodinamikus terápia (PDT)19 és a kromofor-asszisztált lézeres inaktiváció (CALI)20, amelyben a fényérzékenyítőkkel végzett fénybesugárzás szingulett oxigént termel, inaktiválhatja a célfehérjéket vagy sejthalált okozhat.Mivel a szingulett oxigén egy nagyon reaktív anyag, amelynek elméleti diffúziós távolsága körülbelül 70 nm, a fényérzékenyítő körüli térben korlátozott oxidáció szabályozható.Ezen koncepció alapján úgy döntöttünk, hogy szingulett oxigént használunk az élő sejtekben lévő fehérjekomplexek szoros jelölésére.Kidolgoztunk egy PDPL kemoproteomikai megközelítést, amely négy funkciót tölt be: (1) a PL enzimatikus megközelítéshez hasonlóan aktív szingulett oxigén képződésének katalizálása;(2) fényindításkor időfelbontású címkézést biztosítanak;(3) módosítással (4) Kerülje az endogén kofaktorok (például biotin) használatát a háttér csökkentésére, vagy használjon erősen zavaró exogén reagenseket (például peroxidokat), hogy minimalizálja a sejt környezeti stressznek való kitettségét.
A fényérzékenyítők két kategóriába sorolhatók, beleértve a kis molekulatömegű fluoroforokat (pl. bengáli rózsa, metilénkék)22 és a genetikailag kódolt kis fehérjéket (pl. miniSOG, KillerRed)23.A moduláris felépítés elérése érdekében kifejlesztettük az első generációs PDPL platformot a fényérzékenyítő (PS) fehérjék hozzáadásával a POI24,25-höz (1a ábra).Kék fénnyel besugározva a szingulett oxigén oxidálja a proximális nukleofil aminosav-maradékokat, ami elektrofil polaritást eredményez, és tovább reagálhat az aminpróba nukleofilekkel16,17.A szonda alkin fogantyúval rendelkezik, amely lehetővé teszi a kattintás kémiáját és lehúzását az LC/MS/MS jellemzéshez.
A miniSOG által közvetített fehérjekomplexek jelölésének sematikus illusztrációja.Kék fény hatására a miniSOG-POI-t expresszáló sejtek szingulett oxigént termelnek, amely módosítja a kölcsönható fehérjéket, de nem módosítja a nem kötő fehérjéket.A fotooxidáció közbenső termékeit az amin-kémiai szonda reléjei lefogják, így kovalens adduktokat képeznek.A kémiai szondán található alkinilcsoport lehetővé teszi a kattintásos kémiai dúsítást lehúzással, majd LC-MS/MS mennyiségi meghatározásával.b Az aminpróbák kémiai szerkezete 1-4.c Mitokondriális lokalizált miniSOG-mediált proteomikus markerek reprezentatív fluoreszcens gél analízise 1-4 próbákkal és relatív kvantifikációval géldenzitometrián.A kémiai próbák jel-háttér arányát negatív kontrollkísérletekkel, kék fény nélkül, vagy miniSOG expresszió nélküli HEK293T sejtekkel határoztuk meg.n = 2 biológiailag független minta.Minden pont egy biológiai másolatot jelöl.d A PDPL reprezentatív kimutatása és mennyiségi meghatározása az optimalizált 3. szondával a jelzett PDPL komponensek jelenlétében vagy hiányában, például c.n = 3 biológiailag független minta.Minden pont egy biológiai másolatot jelöl.A középvonalak és a whiskerek az átlagot és a ± standard eltérést jelentik.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Szingulett oxigén konfokális képalkotása távoli vörös Si-DMA festéssel.Skála: 10 µm.A gél képalkotást és a konfokális kísérleteket egymástól függetlenül legalább kétszer megismételték hasonló eredménnyel.
Először teszteltük a HEK293T-ben stabilan expresszálódó érett, miniSOG26 és KillerRed23 fotoszenzibilizátorok azon képességét, hogy kémiai próbaként közvetítsék a proteom propargilamin jelölését (1a. kiegészítő ábra).A gélfluoreszcencia analízis azt mutatta, hogy a teljes proteom jelölést miniSOG és kék fénnyel történő besugárzással sikerült elérni, míg a KillerRed esetében nem figyeltek meg látható címkézési terméket.A jel-háttér arány javítása érdekében anilint (1 és 3), propil-amint (2) vagy benzilamint (4) tartalmazó kémiai szondákat teszteltünk.Megfigyeltük, hogy maguk a HEK293T sejtek magasabb háttérjelet mutattak a kék fény hiányához képest, valószínűleg az endogén riboflavin fotoszenzibilizátor, a flavin mononukleotid (FMN) 27 miatt. Az anilin alapú 1. és 3. kémiai próbák jobb specificitást adtak, a HEK293T stabilan expresszálta a miniSOG-t a mitokondriumokban, több mint 8-szoros jelnövekedést mutatva a 3. szondánál, míg a CAP-seq RNS-jelölési módszerben használt 2. próba csak ~2,5-et mutatott. a jel többszörös növekedése, valószínűleg az RNS és a fehérje eltérő reaktivitási preferenciái miatt (1b., c. ábra). Az anilin alapú 1. és 3. kémiai próbák jobb specificitást adtak, a HEK293T stabilan expresszálta a miniSOG-t a mitokondriumokban, több mint 8-szoros jelnövekedést mutatva a 3. szondánál, míg a CAP-seq RNS-jelölési módszerben használt 2. próba csak ~2,5-et mutatott. a jel többszörös növekedése, valószínűleg az RNS és a fehérje eltérő reaktivitási preferenciái miatt (1b., c. ábra).Az anilin alapú 1. és 3. kémiai próbák jobb specificitást mutattak: a HEK293T, amely stabilan expresszálja a miniSOG-ot a mitokondriumokban, több mint 8-szoros jelnövekedést mutat a 3. szondánál, míg a CAP-seq RNS jelölési módszerben használt 2. próba csak ~2,5-szeres jelnövekedést mutat, valószínűleg az RNS és a fehérje eltérő reaktivitási preferenciái miatt (1b., c. ábra).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c)。基于 苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的 ， ， ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 ， 3 的 信号 增加 增加 增加 倍 而 于 于 于 标记 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAz anilin alapú 1. és 3. kémiai próbák specifitása jobb volt, a HEK293T stabilan expresszálta a miniSOG-t a mitokondriumokban, a 3. szonda pedig több mint 8-szoros jel növekedést mutatott, míg a CAP-seq RNS jelölési módszer 2. próbája csak ~2,5-szeres növekedést mutatott.a jelben, valószínűleg az RNS és a fehérje közötti eltérő reakciópreferenciák miatt (1b., c. ábra).Ezenkívül a 3. szonda izomerjeit és a hidrazinpróbákat (5., 6., 7. próbák) teszteltük, megerősítve a 3. szonda optimalizálását (kiegészítő 1b, c ábra).Hasonlóképpen, a gélben végzett fluoreszcencia analízis további optimalizált kísérleti paramétereket tárt fel: besugárzási hullámhossz (460 nm), kémiai szonda koncentrációja (1 mM) és besugárzási idő (20 perc) (kiegészítő 2a–c ábra).A PDPL protokoll bármely komponensének vagy lépésének elhagyása jelentős jelátvitelt eredményezett a háttérbe (1d. ábra).Nevezetesen, a fehérje jelölése jelentősen csökkent nátrium-azid vagy trolox jelenlétében, amelyekről ismert, hogy kioltják a szingulett oxigént.A D2O jelenléte, amelyről ismert, hogy stabilizálja a szingulett oxigént, fokozza a jelölési jelet.Más reaktív oxigénfajták jelöléshez való hozzájárulásának vizsgálatára mannitot és C-vitamint adtak a hidroxil-, illetve szuperoxid gyökfogók létrehozására, 18, 29, de ezek nem csökkentik a jelölést.A H2O2 hozzáadása, de nem a megvilágítás, nem eredményezett jelölést (kiegészítő 3a. ábra).A Si-DMA szondákkal végzett fluoreszcens szingulett oxigén képalkotás megerősítette a szingulett oxigén jelenlétét a HEK293T-miniSOG vezetékben, de nem az eredeti HEK293T vezetékben.Ezenkívül a mitoSOX Red nem tudta kimutatni a szuperoxid képződést megvilágítás után (1e. ábra és 3b. kiegészítő ábra) 30. Ezek az adatok erősen arra utalnak, hogy a szingulett oxigén a fő reaktív oxigénfaj, amely felelős a későbbi proteomikus jelölésért.A PDPL citotoxicitását kékfény-besugárzással és kémiai próbákkal is értékelték, és nem figyeltek meg jelentős citotoxicitást (4a. kiegészítő ábra).
Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk a jelölési mechanizmust és lehetővé tegyük a fehérjekomplexek proteomikai azonosítását LC-MS/MS segítségével, először meg kell határoznunk, hogy mely aminosavak módosultak, és a próba jelölések delta tömegét.Beszámoltak arról, hogy a szingulett oxigén módosítja a metionint, a hisztidint, a triptofánt és a tirozint14,15.A TOP-ABPP31 munkafolyamatot integráljuk az MSFragger32 alapú FragPipe számítási platform által biztosított elfogulatlan nyílt kereséssel.A szingulett oxigénmódosítás és a kémiai szonda jelölése után kattintásos kémiát végeztünk egy hasítható linkert tartalmazó biotin redukciós címkével, majd neutravidin nyújtással és tripszin emésztéssel.A módosított peptidet, még mindig a gyantához kötve, fotolehasították az LC-MS/MS analízishez (2a. ábra és 1. kiegészítő adatok).A proteomban nagyszámú módosítás történt, és több mint 50 peptidtérkép (PSM) egyezés szerepel (2b. ábra).Meglepő módon csak a hisztidin módosulását figyeltük meg, valószínűleg az oxidált hisztidin nagyobb reaktivitása miatt az anilinpróbákkal szemben, mint más aminosavak.A hisztidin szingulett oxigénnel történő oxidációjának publikált mechanizmusa szerint21,33 a javasolt +229 Da delta-tömeg-szerkezet a 3. próba 2-oxo-hisztidinnel alkotott adduktumának felel meg két oxidáció után, míg a +247 Da a hidrolízis terméke. +229 Da (5. kiegészítő ábra).Az MS2 spektrum kiértékelése nagy megbízhatóságot mutatott az y és b ionok többségének azonosítására, beleértve a módosított fragmensionok (y és b) azonosítását (2c. ábra).A PDPL-módosított hisztidinek lokális szekvenciájának kontextusanalízise azt mutatta, hogy a ±1 pozícióban lévő kis hidrofób aminosavak mérsékelt motívumpreferenciája (4b. kiegészítő ábra).Átlagosan 1,4 hisztidint azonosítottunk fehérjénként, és ezeknek a markereknek a helyét az oldószerrel hozzáférhető felület (SASA) és a relatív oldószerelérhetőség (RSA) analízissel határoztuk meg (4c, d kiegészítő ábra).
Elfogulatlan munkafolyamat a maradék szelektivitás tanulmányozásához az MSFragger által hajtott FragPipe számítási platform használatával.A Click kémiában hasítható linkereket használnak, hogy lehetővé tegyék a módosított peptidek fotolehasítását a sztreptavidin gyantáról.Nyílt keresés indult a számos módosítás, valamint a releváns maradványok azonosítására.b Rendelje hozzá a proteomban előforduló módosítások tömegét.Peptid térképezés PSM.c A 3. próbával módosított hisztidin helyek MS2 spektrális annotációja. Reprezentatív példaként egy kovalens reakció a 3. próbával +229,0938 Da hozzáadott a módosított aminosavhoz.d A PDPL markerek tesztelésére használt mutációs vizsgálat.A PRDX3-at (H155A, H225A) és a PRDX1-et (H10A, H81A, H169A) vad típusú plazmidokkal transzfektáltuk az anti-Flag kimutatáshoz.e A szintetikus peptidet tisztított miniSOG-val reagáltattuk a 3. próba jelenlétében, és a megfelelő Δm +247 és +229 termékeket észleltük az LC-MS spektrumban.f In vitro fehérje-fehérje kölcsönhatások miniSOG-6xHis-címkével és anti-6xHis antitesttel modellezve.A 3. próbával jelölt miniSOG-6xHis/anti-6xHis antitest komplexek antibiotin (sztreptavidin-HRP) és anti-egér Western blot analízise a fénynek való kitettség időpontjától függően.Az egyes fehérjék címkéit a megfelelő molekulatömegben fejezzük ki: LC antitest könnyű lánc, HC antitest nehéz lánc.Ezeket a kísérleteket egymástól függetlenül legalább kétszer megismételték hasonló eredménnyel.
A jelölési hely biokémiai ellenőrzéséhez a tömegspektrometriával azonosított PRDX3-at és PRDX1-et hisztidinről alaninra cseréltük, és a vad típusúhoz hasonlítottuk a transzfekciós vizsgálatok során.A PDPL eredmények azt mutatták, hogy a mutáció jelentősen csökkentette a jelölést (2d. ábra).Eközben a nyílt keresés során azonosított peptidszekvenciákat szintetizálták és in vitro tisztított miniSOG-val reagáltatták 3-as próba és kék fény jelenlétében, így +247 és +229 Da tömegeltolódású termékeket kaptak, amikor LC-MS-sel detektáltuk (1. 2e).).Annak tesztelésére, hogy a kölcsönható proximális fehérjék in vitro jelölhetők-e a miniSOG fotoaktivációra válaszul, mesterséges közelségi vizsgálatot terveztünk a miniSOG-6xHis fehérje és egy anti-His monoklonális antitest in vitro kölcsönhatásával (2f ábra).Ebben a vizsgálatban az antitest nehéz és könnyű láncainak proximális jelölését vártuk miniSOG-val.Valójában az anti-egér (az anti-6xHis-jelzett antitest nehéz és könnyű láncait felismerve) és a sztreptavidin Western-blot a nehéz és könnyű láncok erős biotinilációját mutatta.Figyelemre méltó, hogy miniSOG autobiotinilációt észleltünk a 6xHis címke és a könnyű és nehéz láncok közötti keresztkötések miatt, ami összefüggésben lehet a korábban leírt lizin és 2-oxo-hisztidin proximális válasz közötti különbséggel.Összefoglalva, arra a következtetésre jutottunk, hogy a PDPL közelségfüggő módon módosítja a hisztidint.
Következő célunk a szubcelluláris proteom jellemzése volt, hogy teszteljük az in situ jelölés specifitását.Ezért stabilan expresszáltuk a miniSOG-t a HEK293T sejtek sejtmagjában, mitokondriális mátrixában vagy külső ER membránjában (3a. ábra).A gélfluoreszcencia analízis bőséges jelölt sávokat mutatott ki három szubcelluláris helyen, valamint különböző jelölési mintákat (3b. ábra).A fluoreszcens képalkotó elemzés a PDPL magas specificitását mutatta (3c. ábra).A PDPL munkafolyamatot kattintási reakciók követték rodamin festékekkel a szubcelluláris proteomok körülhatárolására fluoreszcens mikroszkóppal, és a PDPL jeleket DAPI-val, mitokondriális nyomkövetőkkel vagy ER nyomkövetőkkel kolokalizáltuk, megerősítve a PDPL nagy pontosságát.A három organellumhely esetében a PDPL és a TurboID egymás melletti összehasonlítása avidin Western blot segítségével azt mutatta, hogy a PDPL specifikusabban jelölődött a megfelelő kontrollokhoz képest.PDPL körülmények között több jelölt sáv jelent meg, ami több PDPL-jelzett fehérjét jelez (kiegészítő 6a-d ábra).
a miniSOG által közvetített organellum-specifikus proteomjelölés sematikus ábrázolása.A miniSOG a mitokondriális mátrixot célozza meg a humán COX4 N-terminális 23 aminosavához (mito-miniSOG), a sejtmagot a H2B-hez (nucleus-miniSOG) és a Sec61β-t az ER membrán citoplazmatikus oldalán keresztül (ER-miniSOG) ).Az indikációk közé tartozik a gél képalkotás, a konfokális képalkotás és a tömegspektrometria.b Három organellum-specifikus PDPL profil reprezentatív gélképei.CBB Coomassie briliánskék.c A miniSOG-t stabilan expresszáló, különböző szubcelluláris lokalizációjú HEK293T sejtek reprezentatív konfokális képei, amelyeket V5 (piros) jelű antitest mutatott ki.Szubcelluláris markereket használnak a mitokondriumokhoz és az ER-hez (zöld).A PDPL munkafolyamat magában foglalja a miniSOG (sárga) jelzésű szubcelluláris proteomok kimutatását Cy3-azid click kémia segítségével.Skála: 10 µm.d PDPL-címkézett proteomok vulkáni diagramja különböző organellumokban, jelöletlen kvantifikációval számszerűsítve (n = 3 független biológiai kísérlet).Kétfarkú Student-féle t-próbát alkalmaztak vulkánparcellákon.Negatív kontrollként HEK293T vad típust használtunk. A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal jelöljük (p < 0,05 és >2-szeres ionintenzitás különbség). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal jelöljük (p < 0,05 és >2-szeres ionintenzitás különbség). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal kiemeljük (p < 0,05 és >2-szeres különbség az ionintenzitásban).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal kiemeljük (p < 0,05 és > 2-szeres különbség az ionerősségben).A HEK293T-miniSOG számára fontos, de a HEK293T számára nem fontos kapcsolódó fehérjék zöld színnel jelennek meg.e A kísérletekből származó proteomikai adatkészletek specificitásának elemzése d.A statisztikailag szignifikáns fehérjék teljes száma az egyes organellumokban (piros és zöld pontok) a tetején van jelölve.A hisztogramok sejtszervecskékben lokalizált fehérjéket mutatnak a MitoCarta 3.0, GO elemzés és A. Ting et al.emberek.Külön adatkészletek a mitokondriumokhoz, a sejtmagokhoz és az ER-hez.Ezeket a kísérleteket egymástól függetlenül legalább kétszer megismételték hasonló eredménnyel.A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
A gél és a képalkotó eredmények ösztönzésére címkézés nélküli kvantifikációt alkalmaztak az azonosított proteomok mennyiségi meghatározására az egyes organellumokban (2. kiegészítő adat).A nem transzfektált HEK293T-t negatív kontrollként használtuk a háttérmarkerek kivonására. A vulkán diagram elemzése szignifikánsan dúsított fehérjéket (p < 0,05 és > 2-szeres ionintenzitás), valamint szingli fehérjéket mutatott ki, amelyek csak a miniSOG-t kifejező vonalakban vannak jelen (3d. ábra piros és zöld pontok). A vulkán diagram elemzése szignifikánsan dúsított fehérjéket (p < 0,05 és > 2-szeres ionintenzitás), valamint szingli fehérjéket mutatott ki, amelyek csak a miniSOG-t kifejező vonalakban vannak jelen (3d. ábra piros és zöld pontok). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). A vulkán plot elemzés szignifikánsan feldúsult fehérjéket (p<0,05 és >2-szeres ionintenzitás), valamint egyedi fehérjéket mutatott ki, amelyek csak a miniSOG-t expresszáló vonalakban vannak jelen (3d. ábra, piros és zöld pontok).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). A vulkándiagram analízis szignifikánsan feldúsult fehérjéket (p<0,05 és >2x ionerősség), valamint csak a miniSOG expressziós vonalban jelen lévő egyetlen fehérjét mutatott ki (piros és zöld pontok a 3d. ábrán).Ezeket az adatokat kombinálva 1364, 461, illetve 911 statisztikailag szignifikáns nukleáris, mitokondriális és ER külső membránfehérjét azonosítottunk.Az organellumokban lokalizált PDPL pontosságának elemzéséhez MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) elemzést és A. Ting et al.adatkészletet8 használtunk a mitokondriumokra, a sejtmagra és az ER-re a detektált fehérjék organellum-specifitásának tesztelésére, ami 73,4, 78,5 és 73,0%-os pontosságnak felel meg (3e. ábra).A PDPL specifitása megerősíti, hogy a PDPL ideális eszköz az organellum-specifikus proteomok azonosítására.Az azonosított mitokondriális fehérjék szubjektokondriális analízise azt mutatta, hogy a befogott proteom főként a mátrixban és a belső membránban (226, illetve 106) oszlik el, ami az azonosított mitokondriális fehérjék teljes számának 91,7%-át (362) teszi ki.a PDPL magas szintjét is megerősítették (7a. kiegészítő ábra).Hasonlóképpen, a szubnukleáris elemzés azt mutatta, hogy a befogott proteom főként a sejtmagban, a nukleoplazmában és a sejtmagban oszlott el (7b. kiegészítő ábra).A nukleáris proteomikai analízis nukleáris lokalizációs szignálpeptiddel (3xNLS) hasonló pontosságot mutatott, mint a H2B konstrukció (kiegészítő 7c-h ábra).A PDPL marker specificitásának meghatározásához a nukleáris laminin A-t választottuk diszkrétebben lokalizált POI7 csapdának.A PDPL 36 szignifikánsan dúsított fehérjét azonosított, amelyek közül 12 fehérje (30,0%-a, beleértve az A-lamint is) a String adatbázis által jegyzett, jól jellemzett, laminált A-val kölcsönhatásba lépő fehérje volt, magasabb százalékaránnyal, mint a BioID módszer (122 fehérje) 28 / 28. , 22,9 %) 7. Módszerünkkel kevesebb fehérjét azonosítottunk, valószínűleg a korlátozott jelölési területek miatt, amit az aktívabb szingulett oxigén tett lehetővé.A GO elemzés kimutatta, hogy az azonosított fehérjék főként a nukleoplazmában (26), a nukleáris membránban (10), a nukleáris membránban (9) és a nukleáris pórusokban (5) helyezkedtek el.Ezek a nukleáris lokalizált fehérjék együttesen a dúsított fehérjék 80%-át tették ki, ami tovább bizonyítja a PDPL specifitását (kiegészítő 8a–d ábra).
Miután megállapítottuk, hogy a PDPL képes-e közelségjelölést végezni az organellumokban, ezután megvizsgáltuk, hogy a PDPL felhasználható-e a POI-kötő partnerek elemzésére.Különösen azon citoszol fehérjék PDPL analízisének meghatározására törekedtünk, amelyek erősen dinamikus természetük miatt nehezebb célpontnak számítanak, mint membránlokalizált társaik.A BRD4 bromodomén és extraterminális (BET) fehérje a különféle betegségekben betöltött kulcsszerepével hívta fel figyelmünket35, 36.A BRD4 által alkotott komplex transzkripciós koaktivátor és fontos terápiás célpont.A c-myc és a Wnt5a transzkripciós faktorok expressziójának szabályozásával a BRD4 az akut mieloid leukémia (AML), a myeloma multiplex, a Burkitt-limfóma, a vastagbélrák és a gyulladásos betegségek kulcsfontosságú meghatározója 37, 38.Ezenkívül egyes vírusok a BRD4-et célozzák a vírus- és sejttranszkripció szabályozására, ilyenek például a papillomavírus, a HIV és a SARS-CoV-236,39.
A BRD4 interakció PDPL segítségével történő feltérképezéséhez a miniSOG-t kombináltuk a BRD4 rövid N- vagy C-terminális izoformájával.A proteomikai eredmények nagyfokú átfedést mutattak a két konstrukció között (kiegészítő 9a. ábra).A miniSOG-H2B-vel azonosított nukleáris proteom a BRD4-gyel kölcsönhatásba lépő fehérjék 77,6%-át fedi le (9b. kiegészítő ábra).Ezután különböző megvilágítási időket (2, 5, 10, 20 perc) használtunk a marker sugarának beállítására (4a. ábra és 3. kiegészítő adat).Arra a következtetésre jutottunk, hogy rövidebb fotoperiódusok esetén a PDPL elsősorban a közvetlen kötőpartnereket jelöli meg, míg a hosszabb periódusok a rövidebb fotoaktivációs periódusok során azonosított fehérjéket, valamint a jelölőkomplexekben lévő közvetett célpontokat is magukban foglalják.Valójában erős átfedést találtunk a szomszédos időpontok között (84,6% 2 és 5 percnél; 87,7% 5 és 10 percnél; 98,7% 10 és 20 percnél) (4b. ábra és 9c. kiegészítő ábra).Valamennyi kísérleti csoportban nemcsak BRD4 öncímkézést találtunk, hanem számos ismert célpontot, mint például a MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A és HMGB1 a karakterlánc-adatbázisban.Ezen célpontok ionereje arányos az expozíciós idővel (4c. ábra és 9d. kiegészítő ábra).A 2 perces csoportban azonosított fehérjék GO analízise azt mutatta, hogy az azonosított fehérjék a sejtmagban lokalizálódnak, és részt vesznek a kromatin remodellingben és az RNS polimeráz működésében.A fehérje molekuláris funkciója kromatinkötésben vagy transzkripciós koaktivációban gazdagodott, összhangban a BRD4 funkcióval (4d. ábra).A karakterlánc-adatbázis-kompatibilis fehérjekölcsönhatás-elemzés a BRD4 és a HDAC családdal kölcsönhatásba lépő komplexek, például a SIN3A, NCOR2, BCOR és SAP130 közötti közvetett kölcsönhatások első szintjét tárta fel (4e. ábra és kiegészítő 9e. ábra), összhangban a BRD4-et és a HDAC-t kötő acetilált hisztonokkal. ..Ezenkívül az LC-MS/MS által azonosított reprezentatív célpontokat, köztük a Sin3A-t, NSUN2-t, Fus-t és SFPQ-t Western-blot-vizsgálattal is megerősítették (4f. ábra).A közelmúltban arról számoltak be, hogy a BRD4 rövid izoformája folyadék-folyadék fázisszétválasztási (LLPS) tulajdonságokkal rendelkező magokat képez.A Fus és az SFPQ RNS-kötő fehérjék különböző sejtfolyamatok LLPS-ét közvetítik, és itt nem rögzített BRD4-kötő fehérjékként azonosították őket.A BRD4 és az SFPQ közötti kölcsönhatást koimmunoprecipitációs (co-IP) kísérletek igazolták (4g ábra), ami egy másik, további vizsgálatot érdemlő mechanizmust sugall a BRD4 által közvetített folyadék-folyadék fázis elválasztáshoz.Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a PDPL ideális platform az ismert BRD4-kölcsönhatásba lépő, valamint az ismeretlen kötőfehérjék azonosítására.
a miniSOG által közvetített BRD4 proximity jelölés sematikus ábrázolása, expozíciós idők: 2, 5, 10 és 20 perc.b A különböző megvilágítási időkben azonosított fehérjék átfedése.A HEK293T-miniSOG-BRD4-ben azonosított fehérjedúsulás statisztikailag szignifikáns volt a vad típusú HEK293T-hez képest.c Ionintenzitás a jelöletlen reprezentatív ismert BRD4-kötő fehérjék számszerűsítésekor a megadott expozíciós idő alatt.n = 3 biológiailag független minta.Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg.d A 2 perces csoportban azonosított fehérjék génontológiai elemzése (GO).Az első tíz GO kifejezés megjelenik.A buborékok a GO kifejezés kategóriája szerint vannak színezve, és a buborékok mérete arányos az egyes kifejezésekben található fehérjék számával.e BRD4-gyel kölcsönhatásba lépő fehérjék sztringanalízise.A sárga körök közvetlen ragasztó, a szürke körök pedig az indirekt ragasztó első rétege.A piros vonalak a kísérletileg meghatározott kölcsönhatásokat, a kék vonalak pedig az előre jelzett kölcsönhatásokat jelzik.f Az LC-MS/MS-ben azonosított reprezentatív BRD4-kötő célpontokat Western blottal igazoltuk.g A ko-immunprecipitációs kísérletek megerősítik az SFPQ és a BRD4 közötti kölcsönhatást.Ezeket a kísérleteket egymástól függetlenül legalább kétszer megismételték hasonló eredménnyel.A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
A nem regisztrált POI-asszociált célpontok azonosítása mellett feltételezzük, hogy a PDPL alkalmas lesz az enzimek szubsztrátjainak azonosítására, amihez a nem regisztrált szubsztrátok annotálásához szükség lenne nagy komplexekben lévő indirekt kötőfehérjék jellemzésére.A Parkin (a PARK2 kódolja) egy E3 ligáz, és a parkin mutációiról ismert, hogy autoszomális recesszív juvenilis Parkinson-kórt (AR-JP) okoznak42.Ezenkívül a parkinról azt írták le, hogy elengedhetetlen a mitofagiához (mitokondriális autofágia) és a reaktív oxigénfajták eltávolításához.Azonban bár számos parkin szubsztrátot azonosítottak, a parkin szerepe ebben a betegségben továbbra is tisztázatlan.Jellemzetlen szubsztrátjainak megjegyzésére a PDPL-t úgy teszteltük, hogy miniSOG-t adtunk a parkin N- vagy C-terminálisához.A sejteket karbonil-cianid proton transzporter m-klórfenilhidrazonnal (CCCP) kezeltük, hogy a PINK1-Parkin útvonalon keresztül aktiváljuk a parkint.A BRD4 PDPL eredményeinkhez képest a parkin N-terminális fúzió a célfehérjék nagyobb készletét tárta fel, bár a C-terminális nagyobb részét fedte le (210-ből 177) (5a, b ábra és 4. kiegészítő adatok).az eredmény összhangban van azokkal a jelentésekkel, amelyek szerint az N-terminális címkék aberráns módon aktiválhatják a Parkin44-et.Meglepő módon adataink között csak 18 átfedő fehérje szerepel a Parkin43-ra publikált AP-MS eredményekkel, valószínűleg a sejtvonalak és a proteomikai munkafolyamatok közötti különbségek miatt.A négy ismert fehérjén (ARDM1, HSPA8, PSMD14 és PSMC3) kívül két módszerrel azonosítottak (5c. ábra)43.Az LC-MS/MS eredményeinek további validálása érdekében PDPL kezelést és ezt követő Western blottingot alkalmaztunk a HEK293T szülősejt vizsgálat és a stabil N-terminális parkin vonal eredményeinek összehasonlítására.A korábban ismeretlen CDK2, DUT, CTBP1 és PSMC4 célpontokat egy ismert kötőanyaggal, a DNAJB1-gyel tesztelték (5d. ábra).
Parkinnal kölcsönhatásba lépő fehérjék vulkándiagramja HEK293T sejtekben stabilan expresszált miniSOG-val fuzionálva a parkin N- vagy C-terminálisához (n = 3 független biológiai kísérlet).Kétfarkú Student-féle t-próbát alkalmaztak vulkánparcellákon.Negatív kontrollként HEK293T-t használtunk. A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal jelöljük (p < 0,05 és >2-szeres ionintenzitás különbség). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal jelöljük (p < 0,05 és >2-szeres ionintenzitás különbség). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal kiemeljük (p < 0,05 és >2-szeres különbség az ionintenzitásban).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). A jelentősen megváltozott fehérjéket pirossal kiemeljük (p < 0,05 és > 2-szeres különbség az ionerősségben).A HEK293T-miniSOG számára fontos, de a HEK293T számára nem fontos kapcsolódó fehérjék zöld színnel jelennek meg.b Venn diagram, amely az N-terminális és C-terminális konstrukciók közötti átfedő fehérjéket mutatja.Az N-terminális címkék aberráns módon aktiválhatják a parkint, és felismerhetőbb fehérjéket eredményezhetnek.c Venn diagram, amely a PDPL és az AP-MS közötti átfedő fehérjéket mutatja.Felsoroljuk az ismert kölcsönhatásokat, beleértve a 18 átfedő fehérje közül 4-et és a PDPL-ben specifikusan azonosított 159 fehérje közül 11-et.d Az LC-MS/MS által azonosított reprezentatív célpontokat Western blottal igazoltuk.Az e Ssu72 és SNW1 nem regisztrált parkin szubsztrátként azonosították.Ezeket a FLAG-címkézett fehérjeplazmidokat HEK293T és HEK293T-Parkin-miniSOG-ba transzfektáltuk, majd CCCP-kezelést végeztünk különböző időpontokban.A degradáció kifejezettebb volt a Parkin-túlexpressziós vonalban.f Az MG132 proteaszóma inhibitor használatával megerősítették, hogy az Ssu72 és SNW1 degradációs folyamatát a proteaszóma-ubikvitináció közvetíti.Ezeket a kísérleteket egymástól függetlenül legalább kétszer megismételték hasonló eredménnyel.A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
Nevezetesen, a PDPL által azonosított fehérjéknek tartalmazniuk kell a parkinkötő fehérjéket és azok szubsztrátjait.A nem regisztrált parkin szubsztrátok kimutatásához hét azonosított fehérjét (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 és SNW1) és transzfektált plazmidokat választottunk ki, hogy ezeket a géneket normális HEK293T-nek tegyük ki, és stabilan expresszálják a miniSOG-Parkin-féle kezelést, majd HEK293 kezelést.Az Ssu72 és SNW1 fehérjék szintje szignifikánsan csökkent a stabil miniSOG-Parkin vonalban (5e. ábra).A 12 órás CCCP-kezelés mindkét szubsztrát legjelentősebb degradációját eredményezte.Annak vizsgálatára, hogy az Ssu72 és SNW1 lebomlását szabályozza-e a proteaszóma-ubikvitináció, az MG132 proteaszóma inhibitort adtuk hozzá a proteaszómaaktivitás gátlására, és valójában azt találtuk, hogy a degradációs folyamatuk gátolt (5f. ábra).További nem szubsztrát célpontokat Parkin-interaktorként igazoltunk Western-blot segítségével (10. kiegészítő ábra), amely konzisztens eredményeket mutatott az LC-MS/MS-sel.Összefoglalva, a PDPL munkafolyamat integrációja a célfehérje transzfekció ellenőrzésével lehetővé teszi a nem regisztrált E3 ligáz szubsztrátok azonosítását.
Kifejlesztettünk egy közös közelségjelző platformot, amely lehetővé teszi a térben és időben kölcsönhatásban lévő POI-k azonosítását.A platform a miniSOG fényérzékenyítő fehérjére épül, amely csak körülbelül 12 kDa, kevesebb mint fele akkora, mint az érett APEX2 enzim (27 kDa), és egyharmada a TurboID méretének (35 kDa).A kisebb méret nagymértékben kibővíti a kis fehérje interaktómák tanulmányozásának alkalmazási körét.További fényérzékenyítő szerek további feltárására van szükség, legyenek azok genetikailag kódolt fehérjék vagy kis molekulák, hogy növeljék a szingulett oxigén kvantumhozamát és bővítsék e megközelítés érzékenységét.A miniSOG jelenlegi verziója esetén nagy időbeli felbontás érhető el kék megvilágítással a közelségjelzők aktiválásához.Ezenkívül a hosszabb expozíciós idő nagyobb szingulett oxigén „felhőt” szabadított fel, ami több distalis hisztidin-maradék módosulását, megnövekedett jelölési sugarat és a PDPL térbeli felbontásának finomhangolását eredményezte.Hét kémiai szondát is teszteltünk a jel-háttér arány növelése érdekében, és feltártuk a megközelítés mögött meghúzódó molekuláris mechanizmust.A TOP-ABPP munkafolyamat elfogulatlan nyílt kereséssel kombinálva megerősítette, hogy módosítások csak a hisztidinekben történtek, és nem figyeltek meg konzisztens mikrokörnyezetet a megnövekedett hisztidin módosulásokra, kivéve a hurokrégióban a hisztidinek mérsékelt preferenciáját.
A PDPL-t olyan szubcelluláris proteomok jellemzésére is használták, amelyek proteomspecifitása és lefedettsége legalább összehasonlítható más proximity jelölési és organellum-specifikus kémiai vizsgálati módszerekkel.A közelségi markereket sikeresen alkalmazták a felszíni, lizoszómális és szekréciós proteomák jellemzésére is46,47.Úgy gondoljuk, hogy a PDPL kompatibilis lesz ezekkel a szubcelluláris organellákkal.Ezenkívül kihívást jelentett a PDPL a citoszol fehérjekötés célpontjainak azonosításával, amelyek összetettebbek, mint a membránhoz kötött fehérjék dinamikus tulajdonságaik és időbelibb kölcsönhatásokban való részvételük miatt.A PDPL-t két fehérjére alkalmaztuk, a BRD4 transzkripciós koaktivátorra és a betegséggel összefüggő E3 Parkin ligázra.Ezt a két fehérjét nemcsak alapvető biológiai funkcióik, hanem klinikai jelentőségük és terápiás potenciáljuk miatt is választották.Ehhez a két POI-hoz jól ismert kötőpartnereket, valamint nem regisztrált célpontokat azonosítottak.Nevezetesen, a fázisszétválasztással összefüggő SFPQ fehérjét a co-IP igazolta, ami egy új mechanizmusra utalhat, amellyel a BRD4 (rövid izoforma) szabályozza az LLPS-t.Ugyanakkor úgy gondoljuk, hogy a Parkin szubsztrátumok azonosítása olyan forgatókönyv, amelyben a közvetett ragasztók azonosítása szükséges.Két azonosítatlan parkin szubsztrátot azonosítottunk, és megerősítettük azok lebomlását az ubikvitináció-proteaszóma útvonalon.A közelmúltban egy mechanizmuson alapuló csapdázási stratégiát fejlesztettek ki a hidroláz szubsztrátok kimutatására enzimekkel történő befogással.Bár ez egy nagyon hatékony módszer, nem alkalmas nagy komplexek képződésében részt vevő szubsztrátok elemzésére, és kovalens kötések kialakítását igényli az enzim és a szubsztrát között.Arra számítunk, hogy a PDPL kiterjeszthető más fehérjekomplexek és enzimcsaládok, például a deubiquitináz és metalloproteáz családok tanulmányozására.
A miniSOG új formáját, a SOPP3-at fejlesztették ki, javított szingulett oxigéntermeléssel.Összehasonlítottuk a miniSOG-t a SOPP3-mal, és javult a jelölési teljesítmény, bár a jel-zaj arány változatlan maradt (11. kiegészítő ábra).Feltételeztük, hogy a SOPP3 optimalizálása (pl. irányított evolúció révén) hatékonyabb fényérzékenyítő fehérjékhez vezet, amelyek rövidebb fényidőt igényelnek, és így dinamikusabb sejtfolyamatok rögzítését teszik lehetővé.Nevezetesen, a PDPL jelenlegi verziója a sejtkörnyezetre korlátozódik, mivel kék fényű megvilágítást igényel, és nem tud behatolni a mély szövetekbe.Ez a tulajdonság kizárja annak használatát állatmodell-vizsgálatokban.Az optogenetika és a PDPL kombinációja azonban lehetőséget nyújthat állatkutatásra, különösen az agyban.Ezenkívül más tervezett infravörös fényérzékenyítők is megszüntetik ezt a korlátozást.Jelenleg is folynak kutatások ezen a területen.
A HEK293T sejtvonalat az ATCC-től szereztük be (CRL-3216).A sejtvonal mikoplazma fertőzésre negatívnak bizonyult, és DMEM-ben (Thermo, #C11995500BT) tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS, Vistech, #SE100-B) és 1% penicillin/sztreptomicinnel (Hyclone, #SV30010).benőtt.
A 3-aminofenilént (3. minta) és a (4-etinil-fenil)-metánamint (4. minta) a Bidepharm-tól vásároltuk.A propil-amint (2. szonda) az Energy-chemicals-tól vásároltuk.Az N-(2-Aminofenil)-pent-4-inamidot (1. próba) publikált módszerek szerint állítottuk elő.
Az 1. kiegészítő táblázat felsorolja a tanulmányban használt genetikai konstrukciókat.A miniSOG és KillerRed szekvenciákat a P. Zou (Peking University) ajándékplazmidjából klónoztuk.A mitokondriális mátrix célzószekvenciáját a COX4 23 N-terminális aminosavából származtattuk, és Gibson összeállítás (Beyotime, #D7010S) segítségével a jelzett vektorokba klónoztuk.Az endoplazmatikus retikulum membránjának és magjának megcélzásához SEC61B humán DNS (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T sejtek cDNS-könyvtárából PCR-rel amplifikált, és H2B DNS (ajánlotta: D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) és klónozott, amint fentebb említettük.Hacsak másképp nem jelezzük, a transzfekcióhoz és stabil sejtvonalak felépítéséhez használt egyéb fehérjegéneket PCR-rel amplifikáltuk a HEK293T sejt cDNS-könyvtárából.G3S-t (GGGS) és G4S-t (GGGGS) használtunk linkerként a csalifehérje és a miniSOG között.Ezekhez a fúziós konstrukciókhoz V5 epitóp címkét (GKPIPNPLLGLDST) adtunk.Az emlősökben történő expresszióhoz és egy stabil sejtvonal létrehozásához a miniSOG fúziós konstrukciót a pLX304 lentivírus vektorba szubklónoztuk.Bakteriális expresszió céljából a miniSOG-t a C-terminálison 6xHis-szel jelölt pET21a vektorba klónoztuk.
HEK293T sejteket 2,0 x 105 sejt/lyuk arányban oltottunk be hatlyukú lemezekre, és 24 órával később rekombináns lentivírus plazmidokkal (2,4 µg pLX304) és víruscsomagoló plazmidokkal (1,5 µg psPAX2 és 1,2 µg psPAX2 és 1,2 µg p0MDBeyo.0gtime) transzfektáltuk, p0MDBeyo. , #C0533), körülbelül 80%-os fúzió.Egy éjszakán át tartó transzfekció után a tápközeget kicseréltük, és további 24 órán át inkubáltuk.A vírus begyűjtése 24, 48 és 72 óra elteltével történt.A célsejtvonalak fertőzése előtt a vírusközeget 0,8 μm-es szűrőn (Merck, #millex-GP) átszűrtük, és polibrént (Solarbio, #H8761) adtunk hozzá 8 μg/ml koncentrációban.24 óra elteltével a sejteket a tápközeg cseréjével hagytuk helyreállni.A sejteket 5 μg/ml blaszticidinnel (Solarbio, #3513-03-9) szelektáltuk az első három passzáláshoz, mint alacsonyabb szigorú szelekciót.Ezután 20 μg/ml-t használtunk szigorúbb adagolási rendként a következő három átoltáshoz.
A sejteket 12 lyukú kamrákba (Ibidi, #81201) oltottuk be, körülbelül 20 000 sejt/lyuk sűrűséggel.A HEK293T sejtek adhéziójának javítása érdekében adjunk hozzá 50 µg/ml fibronektint (Corning, #356008) foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, Sangon, #B640435) hígítva 37 °C-on.A kamrákat 1 órán át előkezeltük, majd PBS-sel eltávolítottuk.24 óra elteltével a sejteket egyszer mostuk PBS-sel, 1 mM próbával 3 inkubáltuk friss Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS, Gibco, #14025092) 1 órán át 37 °C-on, majd kék LED-del (460 nm) inkubáltuk. ).) 10 percig szobahőmérsékleten besugároztuk.Ezt követően a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és 4%-os formaldehiddel PBS-ben (Sangon, #E672002) fixáltuk 15 percig szobahőmérsékleten.A feleslegben lévő formaldehidet háromszor PBS-sel mosva távolítottuk el a rögzített sejtekből.A sejteket ezután PBS-ben készült 0,5%-os Triton X-100-zal (Sangon, #A600198) permeabilizáltuk, és háromszor mostuk PBS-sel.Ezután távolítsa el a kamrát, és minden mintához adjon 25 µl kattintási reakcióelegyet, amely 50 µM Cy3-azidot (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4-et (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA-t (Confluore, #BDJ-4) tartalmaz. és 0,5 mg/ml nátrium-aszkorbátot (Aladdin, no. S105024), majd 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.Snap-reakció után a sejteket hatszor mostuk 0,05% Tween-20-at (Sangon, #A600560) (PBST) tartalmazó PBS-sel, majd 5% BSA-val (Abcone, #B24726) blokkoltuk PBST-ben 30 percig szobahőmérsékleten.
A kolokalizációs immunfestéshez a sejteket primer antitestekkel inkubáltuk a jelzett körülményeknek megfelelően: egér anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), nyúl anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABklonális, #A0564), nyúl poliklonális anti-kalnexin antitest (1:500, Abcam, #ab22595) vagy nyúl anti-lamin A/C monoklonális antitest (1:500; CST, #2032) 4 °C-on egy éjszakán át.Háromszori mosás után PBST-vel a sejteket másodlagos antitestekkel inkubáltuk: kecske anti-nyúl Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000 arányban, kecske anti-egér Alexa Fluor 594 (CST, # 8889) 1:100 hígítás.hígítás Hígítsuk szobahőmérsékleten 30 percig.A sejteket ezután háromszor mostuk PBST-vel, és DAPI-val (Thermo, #D1306) ellenfestettük PBS-ben 10 percig szobahőmérsékleten.Három PBS-mosás után a sejteket 50%-os glicerinben (Sangon, #A600232) PBS-ben lezártuk a képalkotáshoz.Az immunfluoreszcens képeket ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokális mikroszkóp és ZNE 3.5 szoftver segítségével készítettük.
A szingulett oxigénfluoreszcens képalkotáshoz a sejteket kétszer mostuk Hanks HEPES pufferrel, mielőtt 100 nM Si-DMA-t adtunk Hanks HEPES pufferben (DOJINDO, #MT05).Fénynek való kitétel után a sejteket CO2 inkubátorban 37 °C-on 45 percig inkubáltuk.Ezután a sejteket kétszer mostuk Hanks-féle HEPES-pufferrel, majd a Hanks-féle HEPES-pufferben lévő Hoechst-tel ellenfestettük 10 percig szobahőmérsékleten, majd ZEISS LSM 900 konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá., #M36008) kalciumot és magnéziumot tartalmazó HBSS pufferben.Fénynek vagy doxorubicinnek (MCE, #HY-15142A) való expozíció után a sejteket CO2 inkubátorban inkubáltuk 37 °C-on 10 percig, kétszer mostuk HBSS pufferrel, és inkubáltuk Hoechst HBSS pufferben szobahőmérsékleten.percek.Doxorubicint használtunk pozitív próbakontrollként, ahol a sejteket 20 μM doxorubicinnel kezeltük 1% BSA-t tartalmazó HBSS-ben 30 percig.Az immunfluoreszcens képeket Zeiss LSM 900 konfokális mikroszkóppal készítettük.
A mito-miniSOG-t stabilan expresszáló HEK293T sejteket körülbelül 30%-os sűrűséggel oltottuk be 15 cm-es edényekbe.48 óra elteltével, amikor elértük a kb. 80%-os konfluenciát, a sejteket egyszer mostuk PBS-sel, inkubáltuk 1 mM Probe 3-mal friss HBSS pufferben 1 órán át 37°C-on, majd kék LED-del megvilágítottuk 10 percig a szobában. hőfok..Ezt követően a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, lekapartuk és EDTA-mentes proteáz inhibitorokat (MCE, #HY-K0011) tartalmazó jéghideg PBS pufferben újraszuszpendáltuk.A sejteket úgy lizáltuk, hogy a csúcsot 1 percig ultrahanggal kezeltük (1 másodperc be és 1 másodperc kikapcsolva 35%-os amplitúdónál).A kapott elegyet 15 871 xg-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on a törmelék eltávolítása érdekében, és a felülúszó koncentrációját 4 mg/ml-re állítottuk be egy BCA protein assay kit (Beyotime, #P0009) segítségével.Keverjen össze 1 ml fenti lizátumot 0,1 mM fotodegradálható biotin-aziddal (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP-vel (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligandummal (Aladdin, #T162437) és 1 mM CuSO4 inkubátorral. 1 órán át szobahőmérsékleten forgatjuk.Snap-reakció után adjuk hozzá az elegyet az előre összekevert oldathoz (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) egy 10 ml-es üvegfiolában.A mintákat összekevertük és 4500 g-vel centrifugáltuk 10 percig szobahőmérsékleten.Az alsó és felső oldatot eldobtuk, a csapadékot kétszer 1 ml metanollal mostuk, és 15871 × g-vel centrifugáltuk 5 percig 4 °C-on.Adjunk hozzá 1 ml 8 M karbamidot (Aladdin, sz. U111902) 25 mM ammónium-hidrogén-karbonátban (ABC, Aladdin, No. A110539) a csapadék feloldásához.A mintákat 10 mM ditiotreitollal (Sangon, #A100281 25 mM ABC-ben) 40 percig 55 °C-on, majd 15 mM friss jód-acetamidot (Sangon, #A600539) adtunk hozzá szobahőmérsékleten, sötétben.Alkilezés 30 percen belül..További 5 mM ditiotreitolt adtunk hozzá a reakció leállítására.Minden mintához körülbelül 100 µl NeutrAvidin agaróz gyöngyöt (Thermo, #29202) készítsen úgy, hogy háromszor 1 ml PBS-sel mossuk.A fenti proteomoldatot 5 ml PBS-sel hígítottuk, és előmosott NeutrAvidin agaróz gyöngyökkel inkubáltuk 4 órán át szobahőmérsékleten.A gyöngyöket ezután háromszor mostuk 0,2% SDS-t tartalmazó 5 ml PBS-sel (Sangon, #A600485), háromszor 5 ml 1 M karbamidot tartalmazó PBS-sel és háromszor 5 ml ddH2O-val.A gyöngyöket ezután centrifugálással összegyűjtöttük, és 200 μl 25 mM ABC-ben szuszpendáltuk, amely 1 M karbamidot, 1 mM CaCl 2-t (Macklin, #C805228) és 20 ng/μl tripszint (Promega, #V5280) tartalmazott.Tripszinezzük egy éjszakán át 37 °C-on, forgatás mellett.A reakciót hangyasav (Thermo, # A117-50) hozzáadásával állítjuk le, amíg a pH el nem éri a 2-3 értéket.A gyöngyöket háromszor 1 ml 0,2% SDS-t tartalmazó PBS-sel, háromszor 1 ml 1 M karbamidot tartalmazó PBS-sel, majd háromszor 1 ml desztillált vízzel mostuk.A módosított peptideket könnyű lízissel (365 nm) szabadították fel 90 percig 200 μl 70%-os MeOH felhasználásával.Centrifugálás után a felülúszót összegyűjtjük.A gyöngyöket ezután egyszer mostuk 100 μl 70%-os MeOH-val, és a felülúszókat egyesítettük.A mintákat Speedvac vákuumkoncentrátorban szárítottuk, és -20 °C-on tároltuk az elemzésig.
A szingulett oxigénnel módosított peptidek azonosításához és mennyiségi meghatározásához a mintákat újra feloldottuk 0,1%-os hangyasavban, és 1 μg peptidet elemeztünk egy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid tömegspektrométerrel, amely nano ESI forrással volt ellátva a Tune és Xcalibur gyártói szoftver 4.3-tól.A mintákat 75 µm × 15 cm-es, belsőleg töltött kapilláris oszlopon választottuk el 3 µm C18 anyaggal (ReproSil-pur, #r13.b9.), és EASY-nLC 1200 UHPLC rendszerhez (Thermo) csatlakoztattuk.A peptideket lineáris 95 perces gradiens kromatográfiával választottuk el 8% B oldószertől 50% B oldószerig (A = 0,1% hangyasav vízben, B = 0,1% hangyasav 80% acetonitrilben), majd lineárisan 98% B percre növeltük. 6 perc alatt 300 nl/perc áramlási sebesség mellett.Az Orbitrap Fusion Lumos az adatoktól függően felváltva gyűjt adatokat a teljes MS és az MS2 szkennelés között.A porlasztási feszültséget 2,1 kV-ra állítottuk be, az iontranszport kapilláris hőmérséklete pedig 320°C volt.Az MS spektrumokat (350-2000 m/z) 120 000-es felbontással, AGC 4 × 105-tel és 150 ms maximális bemeneti idővel gyűjtöttük.A 10 leggyakoribb többszörösen feltöltött prekurzort minden teljes letapogatás során HCD-vel tördelték fel 30%-os normalizált ütközési energiával, 1,6 m/z-es kvadrupól izolációs ablakkal és 30 000-es felbontással.AGC célpont tandem tömegspektrometriához, 5×104-et és 150 ms maximális bemeneti időt használva.A dinamikus kivétel 30 másodpercre van beállítva. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. A nem meghatározott ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat az MS/MS esetében elutasították.
A nyers adatok feldolgozása az MSFragger alapú FragPipe számítási platformon történik.A tömegeltolódásokat és a megfelelő aminosavakat nyílt keresési algoritmussal határoztuk meg -150 és 500 Da közötti prekurzor tömegtoleranciával.A módosított peptideket ezután hisztidin módosításokkal azonosítottuk +229,0964 és +247,1069 Da tömegnövekedéssel PD-ben (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
A fuzionált miniSOG gént stabilan expresszáló sejteket 6 cm-es edényekbe szélesztettük.A ~80%-os összefolyás elérésekor a sejteket egyszer mostuk HBSS-sel (Gibco, #14025092), majd kémiai próbákkal inkubáltuk HBSS-ben 1 órán át 37 °C-on, és kék fénnyel megvilágítottuk.10 W LED 20 percig szobahőmérsékleten.Annak meghatározására, hogy a PDPL-ben milyen típusú reaktív oxigénfajok vesznek részt, 0,5 mM C-vitamin (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Kiegészítőként 100 mM mannitot (Energy Chemical, #69-65-8), 100 µM H2O2-t, 10 mM NaN3-at adtunk a sejtekhez.Hideg PBS-sel történő mosás után a sejteket lekapartuk, 1,5 ml-es centrifugacsövekbe gyűjtöttük, és hegyével 1 percig ultrahanggal kezeltük 200 μl PBS-ben 1x proteáz inhibitorral EDTA nélkül (1 s és 1 s anélkül, amplitúdó 35%).A kapott elegyet 15 871 x g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, és a felülúszó koncentrációját 1 mg/ml-re állítottuk be egy BCA protein assay kit segítségével.Körülbelül 50 µl fenti lizátumot inkubáltunk 0,1 mM rodamin-aziddal (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP-vel, 0,1 mM TBTA-ligandummal és 1 mM CuSO4-tal 1 órán át szobahőmérsékleten, alulról felfelé forgatva.A kattintási reakció után acetonos kicsapást végeztünk úgy, hogy a mintákhoz 250 μl előhűtött acetont adtunk, -20°C-on 20 percig inkubáltuk, majd 6010×g-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk.Gyűjtsük össze a pelletet, és forraljuk 50 µl 1x Laemmli-pufferben 10 percig 95 °C-on.A mintákat ezután SDS-PAGE hosszú géleken elemeztük, és Bio-rad ChemiDoc MP Touch képalkotó rendszerrel, Image Lab Touch szoftverrel tettük láthatóvá.
A rekombináns miniSOG-6xHis fehérje expresszióját és tisztítását a korábban leírtak szerint végeztük.Röviden, E. coli BL21(DE3) sejteket (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis-szel transzformáltunk, és fehérjeexpressziót indukáltunk 0,5 mM IPTG-vel (Sangon, #A600168).A sejtlízis után a fehérjéket Ni-NTA agaróz gyöngyökkel (MCE, no. 70666) tisztítottuk, PBS-sel szemben dializáltuk, és –80 °C-on tároltuk.
Az antitest-alapú in vitro címkézési vizsgálathoz keverjen össze 100 μM tisztított miniSOG-t, 1 mM próbát 3 és 1 μg jelölő ellenes egér monoklonális antitestet (TransGen, #HT501-01) PBS-ben 50 μl teljes reakciótérfogatig..A reakcióelegyet kék LED fénnyel sugároztuk be 0, 2, 5, 10 és 20 percig szobahőmérsékleten.Az elegyet 0,1 mM biotin-PEG3-aziddal (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP-vel, 0,1 mM TBTA ligandummal és 1 mM CuSO4-tal inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten egy felfelé irányuló rázógépen.Snap-reakció után adjon 4x Laemmli puffert közvetlenül a keverékhez, és forralja 95 °C-on 10 percig.A mintákat SDS-PAGE géleken elemeztük, és Western-blot módszerrel analizáltuk streptavidin-HRP-vel (1:1000, Solarbio, #SE068).
Egy hisztidin tartalmú szintetikus peptidet C-terminális amidálással (LHDALDAK-CONH2) használtunk a közeli peptid alapú in vitro jelölés elemzésére.Ebben a vizsgálatban 100 μM tisztított miniSOG-t, 10 mM próbát 3 és 2 μg/ml szintetikus peptidet kevertünk össze PBS-ben 50 μl teljes reakciótérfogatban.A reakcióelegyet kék LED fénnyel 1 órán át szobahőmérsékleten sugározzuk be.Egy mikroliter mintát LC-MS rendszerrel (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight tömegspektrométer MassLynx spektrumelemző szoftverrel) elemeztünk.
A miniSOG fúziós gént stabilan expresszáló HEK293T sejteket 10 cm-es csészékbe oltottuk a különböző organellum lokalizációjú vonalak (Mito, ER, Nucleus), illetve 15 cm-es csészékbe a Parkin-miniSOG és BRD4-miniSOG vonalak esetében.A ~90%-os összefolyás elérésekor a sejteket egyszer mostuk HBSS-sel, majd a 3. szondával inkubáltuk HBSS-ben 1 órán át 37 °C-on, és szobahőmérsékleten 10 W-os kék LED-del megvilágítottuk.A Parkin érintésmentes jelölésére 10 µM proton-karbonil-cianid hordozó m-klórfenil-hidrazon CCCP-t (Solarbio, #C6700) adtunk a 3. szondával HBSS-ben 1 órára 37 °C-on.A sejtlízis, a kattintási kémia, a redukció és az alkilezés lépései megegyeztek a fent leírtakkal, azzal az eltéréssel, hogy 2 mg lizátumot adtunk hozzá, és a fotodegradálható biotin-azid helyett biotin PEG3-azidot használtunk a kattintási reakcióban.Dúsítás után a gyöngyöket háromszor 5 ml 0,2% SDS-t tartalmazó PBS-sel, háromszor 5 ml 1 M karbamidot tartalmazó PBS-sel és háromszor 5 ml PBS-sel mostuk.Ezt követően 2 µg tripszint adtunk 300 µl 25 mM ABC-hez, amely 1 M karbamidot tartalmazott, hogy a fehérjét egy éjszakán át 37 °C-on hasítsuk.A reakciót hangyasav hozzáadásával állítjuk le, amíg el nem érjük a pH 2-3 értéket.A gyöngyökön végzett tripszinezés után a peptidoldatot SOLAµ HRP oszlopon (Thermo, #60209-001) sómentesítettük, és Speedvac vákuumkoncentrátorban szárítottuk.A peptideket újra feloldottuk 0,1%-os hangyasavban, és 500 ng peptidet analizáltunk a fent leírt nano-ESI forrással felszerelt Orbitrap Fusion Lumos Tribrid tömegspektrométerrel.A peptideket kereskedelmi forgalomban lévő RP-HPLC előoszlopokon (75 μm x 2 cm) (Thermo, 164946 sz.) és analitikai RP-HPLC oszlopokon (75 μm x 25 cm) (Thermo, 164941 sz.) választottuk el, mindkettő 2 μm-rel volt megtöltve.gradiens 8%-ról 35%-ra ACN-ről 60 perc alatt, majd lineárisan 98%-ra B 6 perc alatt 300 Nl/perc áramlási sebesség mellett.Az MS spektrumokat (350-1500 m/z) 60 000-es felbontással, AGC 4 × 105-tel és 50 ms maximális bemeneti idővel gyűjtöttük.A kiválasztott ionokat szekvenciálisan fragmentáltuk HCD-vel 3 másodperces ciklusokban, 30%-os normalizált ütközési energiával, 1,6 m/z-es kvadrupól izolációs ablakkal és 15000 felbontással. 5 × 104 tandem tömegspektrométer AGC célpont és maximális injektálási idő 22 ms-t használtak.A dinamikus kizárás 45 másodpercre van beállítva. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. A hozzá nem rendelt ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat MS/MS esetén elutasítottuk.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. A nem meghatározott ionokat, illetve az 1+ és >7+ töltésű ionokat az MS/MS esetében elutasították.
A minta-előkészítési lépések a NeutrAvidin gyöngyök dúsításáig ugyanazok, mint a fent leírt LC-MS/MS analízisben.Körülbelül 50 μg lizátumot használtunk bemenetként a terhelési kontrollhoz, és 2 mg lizátumot használtunk a kattintási reakciókhoz.Dúsítás és neutravidinnel történő mosás után a megkötött fehérjéket úgy eluáltuk, hogy 50 μl Laemmli-puffert adtunk az agarózgyanta gyöngyökhöz, és 95 °C-on 5 percig forraltuk.A kontrollterhelés bemenetét és a gyöngyökkel dúsított mintákat SDS-PAGE-val elemeztük, és standard Western blot módszerekkel PVDF membránokra (Millipore, #ISEQ00010) vittük át.A membránokat 5% sovány tejjel (Sangon, #A600669) blokkoltuk 0,1% tween-20-at (TBST) tartalmazó TBS-ben, és egymást követően inkubáltuk primer és másodlagos antitestekkel.Az elsődleges antitesteket 1:1000 arányban hígítottuk 5%-os sovány tejben TBST-ben, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk.A másodlagos antitesteket 1:5000 arányban alkalmaztuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk.A membránokat kemilumineszcenciával tettük láthatóvá Chemidoc MP képalkotó rendszer segítségével.Az ábrán a blotokról és gélekről készült összes vágatlan szkennelés nyers adatként szerepel.
A vizsgálatban használt elsődleges antitestek közé tartozik a nyúl anti-SFPQ monoklonális antitest (CST, no. 71992), nyúl anti-FUS monoklonális antitest (CST, no. 67840), nyúl anti-NSUN2 poliklonális antitest (Proteintech, no. 20854-1-). AP), nyúl anti-mSin3A poliklonális antitest (Abcam, #ab3479), egér anti-tag monoklonális antitest (TransGen, #HT201-02), egér anti-β-aktin monoklonális antitest (TransGen, #HC201-01), nyúl antitest -CDK2 monoklonális antitest (ABclonal, #A0094), nyúl monoklonális antitest CTBP1 ellen (ABclonal, #A11600), nyúl poliklonális antitest DUT ellen (ABclonal, #A2901), nyúl poliklonális antitest PSMC4 ellen (ABklonális, nyúl anti-05), #A2 anti-05 DNAJB1 poliklonális antitest (ABclonal, # A5504).Ezeket az antitesteket 1:1000 hígításban alkalmaztuk 5%-os sovány tejben TBST-ben.A vizsgálatban használt másodlagos antitestek közé tartozik az anti-nyúl IgG (TransGen, #HS101-01), az anti-egér IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 hígításban.
Annak további vizsgálatára, hogy a BRD4 kölcsönhatásba lép-e az SFPQ-val, a HEK293T-t túlzottan expresszáló stabil HEK293T és BRD4-miniSOG sejteket 10 cm-es edényekbe szélesztettük.A sejteket hideg PBS-sel mostuk, és 1 ml Pierce IP lízispufferben (Thermo Fisher, #87787) EDTA-mentes proteáz inhibitorral lizáltuk 30 percig 4 °C-on.Ezt követően a lizátumokat 1,5 ml-es centrifugacsövekbe gyűjtöttük, és 15 871 xg-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on.A felülúszót összegyűjtöttük, és 5 µg anti-V5 jelölt egér monoklonális antitesttel (CST, #80076) egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk.Mossunk át körülbelül 50 µl protein A/G mágneses gyöngyöt (MCE, #HY-K0202) kétszer 0,5% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel.Ezután a sejtlizátumokat mágneses gyöngyökkel inkubáltuk 4 órán át 4 °C-on alulról felfelé forgatva.Ezután a gyöngyöket négyszer mostuk 1 ml PBST pufferrel, és 95 °C-on 5 percig forraltuk.A mintákat SDS-PAGE géleken elemeztük, és standard Western blot módszerekkel PVDF membránokra vittük át.A membránokat 5%-os sovány tejben blokkoltuk TBST-ben, és egymást követően inkubáltuk primer és másodlagos antitestekkel.Elsődleges antitest Nyúl anti-SFPQ monoklonális antitestet (CST, #71992) alkalmaztunk 1:1000 arányban 5%-os sovány tejben TBST-ben, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk.Az anti-nyúl IgG-t 1:5000 arányban alkalmaztuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk.A membránokat kemilumineszcenciával tettük láthatóvá Chemidoc MP képalkotó rendszer segítségével.
A Solvent Accessible Surface Area (SASA) elemzéséhez használt összes struktúra a Protein Data Bank (PDB)52 vagy az AlphaFold Protein Structure Database53 adatbázisból származott.Az abszolút SASA-t a FreeSASA programmal minden maradékra kiszámítottuk.Csak a jelölt hisztidinre és szomszédaira vonatkozó teljes és egyértelmű SASA-adatokat használtuk az egyes szerkezetek átlagos SASA-értékének meghatározásához.Az egyes hisztidinek relatív oldószer hozzáférhetőségét (RSA) úgy számítottuk ki, hogy az abszolút SASA értéket elosztottuk az oldószer számára elérhető maximális maradék felülettel.Ezután minden hisztidint rejtettnek minősítettek, ha az átlagos RSA 20% alatt volt, egyébként exponált56.
A DDA módban kapott nyers fájlokat Proteome Discoverer (v2.5) vagy MSfragger (Fragpipe v15.0) segítségével kerestük a megfelelő SwissProt ellenőrzött fehérjeadatbázisban, amely gyakori szennyeződéseket tartalmazott.A peptidekhez komplett tripszinre volt szükség két hiányzó hasítási hellyel, fix módosításként karbamoil-metilációt és dinamikus módosításként metionin-oxidációt.A prekurzor és a fragmens súlytűrését 10 ppm-re, illetve 0,02 Da-ra (MS2 Orbitrap) állítottuk be. A szennyező találatokat eltávolítottuk, és a fehérjéket kiszűrtük, hogy 1%-nál kisebb hamis felfedezési arányt kapjunk. A szennyező találatokat eltávolítottuk, és a fehérjéket kiszűrtük, hogy 1%-nál kisebb hamis felfedezési arányt kapjunk. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфнищих коэфнищих коэфнифулио%. A szennyező találatokat eltávolítottuk, és a fehérjéket kiszűrtük, hogy a téves kimutatási arány <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложнинху1%. A szennyező találatokat eltávolítottuk, és a fehérjéket kiszűrtük, hogy a téves pozitív arány elérje az 1%-ot.A jelölések nélküli kvantitatív analízishez három biológiai ismétlésből származó normalizált fehérjetartalmat használtunk.A fehérje szubcelluláris lokalizációs elemzését a DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 Gene Ontology (GO) elemzésével és az Alice Ting csoport által összeállított és közzétett adatbázisokkal végeztük.A vulkántérképet a Perseustól szereztük be (v1.6.15.0). A fehérjebőség-szoros változások statisztikai szignifikanciáját kétoldalú t-próbával teszteltük, és a fehérje találatokat 2-nél nagyobb bőség-változással (hacsak másképp nem jelezzük) és p-értékkel <0,05-tel azonosítottuk. A fehérjebőség-szoros változások statisztikai szignifikanciáját kétoldalú t-próbával teszteltük, és a fehérje találatokat 2-nél nagyobb bőség-változással (hacsak másképp nem jelezzük) és p-értékkel <0,05-tel azonosítottuk. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. A fehérjetartalom-szoros változások statisztikai szignifikanciáját kétirányú t-próbával teszteltük, és a fehérjeegyezéseket 2-nél nagyobb tartalomváltozással (hacsak másként nem jelezzük) és 0,05 ap értékkel azonosítottuk.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， ， 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化 变化 （另 有 说明） 和 和 和 值 <0,05。。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 的 丰度 变化 变化 变化 变化 （另 有 说明 说明 和 和 值 <0,05。。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. A fehérjetartalom többszörös változásának statisztikai szignifikanciáját kétirányú t-próbával teszteltük, és a fehérjeegyezéseket a 2-nél nagyobb tartalomváltozások (hacsak másképp nem jelezzük) és a p-értékek <0,05 esetén határoztuk meg.A fehérjekölcsönhatás elemzését GO elemzéssel és a String adatbázissal végeztük.
Három biológiai ismétlést végeztünk hasonló eredménnyel.A statisztikai elemzés a GraphPad Prism (GraphPad szoftver) segítségével történt, a vulkán diagramokat pedig a Perseus (v1.6.15.0) programmal készítettem.A két csoport összehasonlításához a p-értékeket kétirányú Student-féle t-próbával határoztuk meg.Csak a kísérleti csoportban legalább kétszer azonosított singleton fehérjék kerültek be a vulkán parcellákba, és a megfelelő hiányzó értékeket a kontrollcsoportban a normál eloszlásból származó Perseus-szal helyettesítették, hogy a p-értéket ki lehessen számítani.A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.A statisztikai elemzéshez szükséges proteomikai analízis során a legalább két biológiai ismétlésben megjelent fehérjék bősége megmaradt.Statisztikai módszereket nem használtak a minta méretének előre meghatározására.A kísérletek nem véletlenszerűek.A kutatók a kísérlet és az eredmények értékelése során nem voltak vakok a feladatokra.
A tanulmány tervezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg a természetkutatási jelentés absztraktot, amely ehhez a cikkhez kapcsolódik.
Az ebben a vizsgálatban kapott tömegspektrometriás adatokat a ProteomeXchange Konzorciumnak nyújtották be az iProX57 partner adattáron keresztül PXD034811 adatkészlet azonosítóval (PDPL-MS adatkészlet).A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.Ez a cikk az eredeti adatokat tartalmazza.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ismerkedés a környékkel: közelségfüggő biotiniláció alkalmazása fehérjekomplexek jellemzésére és organellumok feltérképezésére. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ismerkedés a környékkel: közelségfüggő biotiniláció alkalmazása fehérjekomplexek jellemzésére és organellumok feltérképezésére.Gingras, AS, Abe, KT és Raut, B. Környezetismeret: közelségfüggő biotiniláció alkalmazása fehérjekomplexek jellemzésére és organellumok feltérképezésére. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. A szomszédság megértése: használja a környék biológiai élettől való függőségét.Gingras, AS, Abe, KT és Raut, B. A közelség megértése: fehérjekomplexek jellemzése és organellumok feltérképezése közelségfüggő biotiniláció segítségével.Jelenlegi.Véleményem.Kémiai.biológia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.A mikrokörnyezet feltérképezése a Dexter-energia átvitelével az immunsejtekbe.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.A kétproteómás léptékű hálózatok észlelik az emberi interaktóma sejtspecifikus átalakulását.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).