hírek

A fertőző betegségek kimutatására szolgáló hagyományos diagnosztikai stratégiák olyan asztali műszerek használatát teszik szükségessé, amelyek nem alkalmasak az ellátási pontok (POCT) vizsgálatára.A feltörekvő mikrofluidika egy nagymértékben miniatürizált, automatizált és integrált technológia, amely a hagyományos módszerek lehetséges alternatívája a gyors, alacsony költségű, pontos helyszíni diagnosztika érdekében.A molekuláris diagnosztikai módszereket széles körben alkalmazzák a mikrofluidikus eszközökben, mint a kórokozók kimutatásának leghatékonyabb módszereit.Ez az áttekintés összefoglalja a fertőző betegségek mikrofluidikai alapú molekuláris diagnosztikájának legújabb eredményeit tudományos és ipari szempontból egyaránt.Először a nukleinsavak tipikus chip-feldolgozását írjuk le, beleértve a minta előkezelését, amplifikációját és jelleolvasását.Ezután összehasonlítjuk a négyféle mikrofluidikus platform jellemzőit, előnyeit és hátrányait.Ezután a nukleinsavak abszolút mennyiségi meghatározására szolgáló digitális tesztek alkalmazását tárgyaljuk.Mind a klasszikus, mind a közelmúltban kereskedelmi forgalomba hozott, mikrofluidikus alapú molekuláris diagnosztikai eszközöket a piac jelenlegi állapotának bizonyítékaként összegezzük.Végül javaslatot teszünk a fertőző betegségek mikrofluidikus diagnosztikájának jövőbeli irányaira.
A fertőző betegségeket kórokozók, köztük baktériumok, vírusok és paraziták okozzák, amelyek az egész világon elterjedtek.Más betegségektől eltérően a kórokozók gyorsan megfertőződnek, és oltással, levegővel és vízi közeggel terjednek az emberek és a gazdaállatok között [1].A fertőző betegségek megelőzése kulcsfontosságú közegészségügyi intézkedésként.Három fő stratégia a fertőző betegségek leküzdésére: (1) a fertőzés forrásának ellenőrzése;(2) az átviteli út megszakítása;(3) a fogékony populációk védelme.A fő stratégiák közül a fertőzés forrásának ellenőrzését tartják a legfontosabb stratégiának kényelme és alacsony költsége miatt.A fertőzött egyének gyors diagnosztizálása, izolálása és kezelése kritikus fontosságú, gyors, érzékeny és pontos diagnosztikai stratégiákat igényel [2].A fertőző betegségek jelenlegi diagnosztizálása általában kombinálja a jeleken és tüneteken alapuló klinikai vizsgálatot, valamint olyan laboratóriumi vizsgálatokat, mint a sejtkultúra és a molekuláris diagnosztika, amelyekhez képzett személyzetre, munkaigényes eljárásokra és drága vizsgálóberendezésekre van szükség [3, 4].A fertőző betegségek kitörésének megelőzése gyors, olcsó és pontos helyi diagnózist tesz szükségessé, különösen az erőforrások által korlátozott területeken, ahol a fertőző betegségek gyakoriak és súlyosak [5], valamint a vadonban vagy a harctéren történő kezelést, ahol a vészhelyzetek előre nem láthatók..az orvosi ellátás korlátozott [6].Ebben az összefüggésben a mikrofluidika olyan technológia, amely a mikroelektromechanikai rendszertechnológiákat, a nanotechnológiát vagy az anyagtudományt ötvözi a precíz folyadékmanipuláció érdekében [7,8,9,10], új lehetőségeket biztosítva a POCT-felismeréshez.) fertőző ágensek a kórházakon és laboratóriumokon kívül.A hagyományos időigényes diagnosztikához képest a mikrofluidikai technológia minta- és költségmegtakarítást kínál a molekuláris diagnosztika során a betegségek kitörése során.A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) globális terjedését a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) okozza, ezért ismét hangsúlyozzák a mikrofluidika fontosságát a járvány időben történő megelőzésében és leküzdésében [11, 12 , 13].A hagyományos diagnosztikától eltérően a mikrofluidikus POCT kis hordozható eszközöket használ az asztali elemzőktől a kis oldaláramú tesztcsíkokig a mintavételi pont közelében végzett teszteléshez [14].Ezek a tesztek egyszerűsített minta-előkészítést vagy egyáltalán nem, gyors jelerősítést és érzékeny jelleolvasást tartalmaznak, ami rövid időtartamú és perceken belül pontos eredményt eredményez.A mikrofluidikus alapú egészségügyi műszerek elérhetősége és tömeggyártása kibővítette költséghatékony és közvetlen diagnosztikai alkalmazásaikat a kórházon kívül, a beteg közelében, sőt otthon is.
A fertőző betegségek diagnosztizálására szolgáló meglévő stratégiák közül a molekuláris diagnosztika az egyik legérzékenyebb [15, 16].Ezenkívül a molekuláris diagnosztikát gyakran használják aranystandardként a COVID-19 folyamatos kimutatására, amely lehetővé teszi az RNS vagy DNS vírusspecifikus régióinak közvetlen kimutatását az immunválasz kialakulása előtt [17, 18].A mostani áttekintésben a fertőző betegségek mikrofluidikai alapú molekuláris diagnosztikai eljárásainak legújabb vívmányait mutatjuk be, tudományos szempontból a jövő ipari perspektíváiig (1. ábra).A nukleinsav-detektálás három kulcsfontosságú lépésével kezdjük: a chipen lévő minta előkezelésével, a nukleinsav-amplifikációval és a jelolvasással.Ezután összehasonlítottuk a különböző típusú mikrofluidikus platformokat szerkezetükkel és funkciójukkal, egyedi jellemzőket (erősségeket és gyengeségeket) mutatva.A digitális nukleinsav-detektálást tovább tárgyalják, és példaként adják a fertőző patogén molekulák abszolút mennyiségi meghatározására szolgáló harmadik generációs technológiára.Emellett számos tipikus és legújabb kereskedelmi forgalomban kapható POCT-eszköz is bemutatásra kerül a molekuláris diagnosztika mikrofluidikus POCT-piacának jelenlegi állapotának bemutatására.Megbeszéljük és elmagyarázzuk a jövőbeli alkalmazásokra vonatkozó elképzeléseinket is.
A nukleinsav kimutatására szolgáló mikrofluidikus chipek moduljait funkciójuk szerint három kategóriába sorolhatjuk (mintavétel, felismerés és jelátvitel) [19].Ezen modulok közül a mintavételi modul főként mintalízist és nukleinsav extrakciót valósít meg.Az érzékelő modul elsősorban a nukleinsav jelek átalakítását és erősítését vezérli.A jelzőmodul érzékeli az érzékelő modul által átalakított és feldolgozott jelet.A nukleinsavak chipen történő kimutatásának folyamata alapján összefoglaljuk azokat a különböző chipeket, amelyek képesek megvalósítani az „input and output” funkciót.
A nukleinsav kimutatás első lépése a nukleinsav extrakció, azaz a célnukleinsav izolálása az eredeti mintából.A nukleinsav extrakciót a nukleinsavak más molekuláris szennyeződésektől való megtisztítására, a nukleinsavmolekulák elsődleges szerkezetének integritásának biztosítására és az eredmények optimalizálására hajtják végre.A nukleinsav extrakció megköveteli a szükséges minta lízist és nukleinsav befogást, melynek minősége és hatékonysága óriási hatással van a kutatási és diagnosztikai eredményekre.Az extrakció során fellépő bármilyen finom mellékhatás korlátozhatja a további észlelést.Például a polimeráz láncreakció (PCR) és a hurok izotermikus amplifikációs (LAMP) módszereket gátolja néhány szerves oldószer, például etanol és izopropanol a nukleinsav-izoláló reagensekben [20].A folyadék-folyadék extrakció és a szilárd fázisú extrakció a legnépszerűbb módszerek a nukleinsavak izolálására [21], azonban a chipen történő folyadék-folyadék extrakció rendkívül korlátozott, mivel a folyadék-folyadék extrakcióban használt reagensek a legtöbb mikrofluid chip korrózióját okozzák. .Itt kiemeljük a microarray alapú szilárd fázisú extrakciós módszereket, és összehasonlítjuk azok előnyeit és hátrányait.
A szilícium biokompatibilitása, stabilitása és könnyű módosíthatósága miatt a nukleinsavakkal kompatibilis szubsztrát anyag [22].Fontos, hogy szilícium-dioxiddal vagy más anyagokkal módosítva ez a kompozit olyan tulajdonságokat mutat, hogy adszorbeálja a negatív töltésű nukleinsavakat alacsony pH-n, magas sótartalmú körülmények között, miközben magas pH-jú, alacsony sótartalmú oldatokkal eluál.E jelenség alapján lehetséges a nukleinsav tisztítása.
A szilícium-dioxid alapú anyagok különféle formáit használták a mikrofluidikai nukleinsav extrakcióhoz, például szilícium-dioxid gyöngyöket, porokat, mikroszálas szűrőket és szilícium-dioxid membránokat [23, 24, 25, 26].Az anyag tulajdonságaitól függően a szilícium alapú anyagok különböző módon alkalmazhatók mikroáramkörökben.Például a szilícium-dioxid granulátumok, porok és kereskedelmi forgalomban kapható nanoszűrők egyszerűen behelyezhetők a mikrofluid chipek pórusaiba vagy mikrocsatornáiba, és elősegíthetik a nukleinsavak kinyerését a mintákból [27, 28, 29].Felületmódosított szilícium-dioxid membránok is használhatók a DNS gyors tisztítására a kórokozóktól alacsony költséggel.Például Wang és mtsai.[30] A denaturáló amplifikációs reakciók vezikula által közvetített lánccserével és kitozán-oligoszacharidokkal bevont szilícium-dioxid membránokkal való kombinálásával egy sokoldalú hordozható rendszert vezettek be, amely sikeresen detektált 102-108 telepképző egységet.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., és a vírus jelenléte jól látható volt.Powell et al.[31] Ezután szilícium alapú microarray-eket használtak a hepatitis C vírus (HCV), a humán immunhiány vírus (HIV), a Zika vírus és a humán papillomavírus kimutatására és az automatikus szaporításra, amelyben egy 1,3 μl-es kanyargós mikroreaktort fejlesztettek ki az RNS vírusok befogására.és in situ erősítést végezzen.Ezen eljárások mellett a felületmódosított szilícium-dioxid mikrooszlopok is kulcsszerepet játszanak a nukleinsav extrakcióban, mivel a módosító anyag geometriája és tulajdonságai nagymértékben növelik az extrakció hatékonyságát.Chen et al.[32] egy mikrofluidikus platformot javasolt alacsony koncentrációjú RNS izolálására amino-bevonatú szilícium mikrooszlopokon.Ez a mikrofluidikus eszköz 0,25 cm2-es mikropillérek sorát integrálja egy szilícium hordozóra, hogy nagyobb extrakciós hatékonyságot érjen el a nagy felület/térfogat arányú kialakítás révén.Ennek a kialakításnak az az előnye, hogy a mikrofluidikus eszköz akár 95%-os nukleinsav-kivonási hatékonyságot is képes elérni.Ezek a szilícium-alapú stratégiák demonstrálják a nukleinsavak gyorsan és alacsony költséggel történő izolálásának értékét.Mikrofluidos chipekkel kombinálva a szilícium alapú extrakciós stratégiák nemcsak a nukleinsav-detektálás hatékonyságát növelhetik, hanem az analitikai eszközök miniatürizálását és integrálását is elősegítik [20].
A mágneses elválasztási módszerek mágneses részecskéket használnak a nukleinsavak külső mágneses tér jelenlétében történő izolálására.Az általánosan használt mágneses részecskék közé tartoznak a szilícium-dioxiddal, amino-val és karboxillal bevont Fe3O4 vagy γ-Fe2O3 mágneses részecskék [33,34,35,36].A mágneses részecskék megkülönböztető jellemzője a szilícium alapú SPE módszerekhez képest a könnyű manipuláció és külső mágnesekkel történő vezérlés.
A nukleinsavak és a szilícium-dioxid elektrosztatikus kölcsönhatása révén magas só és alacsony pH mellett a nukleinsavak adszorbeálódnak a szilícium-dioxiddal bevont mágneses részecskék felületén, míg alacsony só és magas pH mellett a molekulák moshatók. újra..A szilícium-dioxiddal bevont mágneses gyöngyök lehetővé teszik a DNS kinyerését nagy térfogatú (400 μL) mintákból mágnesesen szabályozott mozgással [37].Demonstrációként Rodriguez-Mateos et al.[38] hangolható mágneseket használt a mágneses gyöngyök különböző kamrákba való átvitelének szabályozására.Szilícium-dioxiddal bevont mágneses részecskék alapján 470 kópia/ml SARS-CoV-2 genomi RNS kinyerhető a szennyvízmintákból LAMP reverz transzkripciós detektáláshoz (RT-LAMP), és a válasz 1 órán belül leolvasható.szabad szemmel (2a. ábra).
Mágneses és porózus anyagokon alapuló eszközök.A SARS-CoV-2 RNS kimutatására szolgáló IFAST RT-LAMP mikrofluidikus eszköz fogalmi diagramja (adaptált a [38]-ból).b Centrifugális mikroeszköz bukkális tampon nukleinsav dSPE-hez (adaptált a [39]-ből).c Beépített saját tápellátású mintakoncentrátor FTA® kártyával (adaptált az [50]-ből).d Kitozánnal módosított Fusion 5 szűrőpapír (adaptált az [51]-ből).SARS-CoV-2 súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2, RT-LAMP reverz transzkripció hurok által közvetített izotermikus amplifikáció, FTA Finders technológiai partnerek, NA nukleinsav
A pozitív töltésű mágneses részecskék ideálisak a nukleinsav foszfátvázának rögzítésére.Egy bizonyos sókoncentrációnál a nukleinsavak negatív töltésű foszfátcsoportjai pozitív töltésűek lehetnek a mágneses kompozit részecskék felületén.Ezért nukleinsavak extrakciójára durva felületű és nagy aminocsoportsűrűségű mágneses nanorészecskéket fejlesztettek ki.A mágneses elválasztás és blokkolás után a mágneses nanorészecskék és DNS-komplexek közvetlenül felhasználhatók a PCR-ben, így nincs szükség bonyolult és időigényes tisztítási és elúciós műveletekre [35].Negatív karboxilcsoportokkal bevont mágneses nanorészecskéket is alkalmaztak nagy koncentrációjú polietilénglikol és nátrium-klorid oldatokban a felületeken adszorbeált nukleinsavak elválasztására [36].Ezekkel a felületmódosított mágneses gyöngyökkel a DNS-kivonás kompatibilis a későbbi amplifikációval.Dignan et al.[39] egy automatizált és hordozható centrifugális mikrofluidikus platformot írt le nukleinsav-előkezeléshez, amely lehetővé tette a nem műszaki személyzet számára a helyszínen történő használatát.Ezen túlmenően, az izolált DNS kompatibilitása a LAMP-val, amely módszer jól alkalmas a nukleinsavak gondozási pontja szerinti elemzésére, tovább bizonyítja a minimális felszerelési követelményeket és a kolorimetriás vizsgálatokhoz való alkalmasságot (2b. ábra).
A mágneses gyöngyök módszerei lehetővé teszik az automatizált extrakciót, amelyek közül néhány megtalálható a kereskedelemben kapható automatizált nukleinsav extrakciókban [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kína) és Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].A mágneses gyöngyök mikrofluidikával való kombinálásának előnyei felhasználhatók a nukleinsavak hatékony automatizált extrakciójára, ami potenciálisan előmozdíthatja a molekuláris diagnosztika fejlődését;azonban a mágneses gyöngyök és a mikrofluidikák kombinációja továbbra is nagymértékben támaszkodik a mágneses gyöngyök precíz manipulálására szolgáló összetett vezérlőrendszerekre, ami megmagyarázza a kereskedelmi termékek terjedelmes és drága népszerűségét, ami korlátozza a mágneses gyöngyök további alkalmazását a POCT-ban.
Számos porózus anyagot, például módosított nitrocellulóz szűrőket, Finders Technology Associates (FTA) kártyákat, poliéterszulfon alapú szűrőpapírokat és glikánnal bevont anyagokat is használtak a nukleinsav kimutatására [40, 41, 42, 43, 44].A porózus rostos anyagokat, például a rostos papírt először a DNS izolálására használták a hosszú szálú DNS-molekulák rostokkal való fizikai összefonásával.A kis pórusok a DNS-molekulák erős fizikai korlátozásához vezetnek, ami pozitívan befolyásolja a DNS-kivonást.A rostos papír eltérő pórusmérete miatt az extrakció hatékonysága nem tudja kielégíteni a DNS-amplifikáció igényeit [45, 46].Az FTA-kártya egy kereskedelmi forgalomban kapható szűrőpapír, amelyet a törvényszéki orvostan területén használnak, és széles körben alkalmaznak a molekuláris diagnosztika más területein is.A különböző vegyszerekkel impregnált cellulóz szűrőpapír használatával a mintában lévő sejtmembránok lizálására a felszabaduló DNS akár 2 évig is védett a lebomlástól.Újabban impregnált cellulózpapírt fejlesztettek ki különféle kórokozók, köztük a SARS-CoV-2, a leishmaniasis és a malária molekuláris kimutatására [47,48,49].Az izolált plazmában lévő HIV közvetlenül lizálódik, és a vírus nukleinsav feldúsul a koncentrátorba épített FTA® flow membránban, ami lehetővé teszi a nukleinsav hatékony termelését [50] (2c. ábra).A nukleinsav FTA-kártyákkal történő kimutatásának fő problémája az, hogy az olyan vegyszerek, mint a guanidin és az izopropanol, gátolják a későbbi amplifikációs reakciókat.A probléma megoldására kifejlesztettük a Fusion 5 kitozánnal módosított szűrőpapírt, amely a DNS-molekulák és a rostos szűrőpapír fizikai átlapolásának, valamint a DNS kitozánnal módosított vegyületeken való elektrosztatikus adszorpciójának előnyeit ötvözi a rendkívül hatékony nukleinsav-kivonás elérése érdekében. ..szűrőszálak [51] (2d. ábra).Hasonlóképpen Zhu és mtsai.[52] egy in situ kapilláris mikrofluidikus rendszeren alapuló kitozánnal módosított PCR-módszert mutatott be a Zika-vírus RNS-ének gyors izolálására és kimutatására.A nukleinsavak adszorbeálhatók/deszorbeálhatók vegyes lizátum/PCR tápközegben, a kitozán be/kikapcsoló tulajdonsága alapján.be és ki”, a pH-ra érzékeny.
Mint fentebb említettük, ezek a stratégiák egyesítik a különböző szilárd fázisú anyagok előnyeit, és növelik a nukleinsav extrakció hatékonyságát a mikrofluidikában.A gyakorlati alkalmazásokban ezeknek az anyagoknak a nagy mennyiségben történő felhasználása gazdaságtalan, és a szokásos anyagok megfelelő felületkezelése vagy felületmódosítása ezekkel az anyagokkal is megőrizheti funkciójukat.Ezért úgy gondolják, hogy ezeknek a stratégiáknak a kísérleti tanulmány utáni végrehajtása csökkentheti a költségeket.
A mikrofluidikus platformokon végzett nukleinsavtesztek gyakran kis mintatérfogatokat (< 100 µl) használnak, ezért a célnukleinsavakat specifikus próbákkal kell amplifikálni, hogy olyan jellé alakuljanak át, amely alkalmas a downstream detektáláshoz (optikai, elektromos és mágneses) [53, 54]. A mikrofluidikus platformokon végzett nukleinsavtesztek gyakran kis mintatérfogatokat (< 100 µl) használnak, ezért a célnukleinsavakat specifikus próbákkal kell amplifikálni, hogy olyan jellé alakuljanak át, amely alkalmas a downstream detektáláshoz (optikai, elektromos és mágneses) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. A nukleinsavak mikrofluidikus platformokon történő tesztelésekor gyakran használnak kis mintatérfogatot (<100 µL), ezért a célnukleinsavak speciális szondákkal történő amplifikációja szükséges ahhoz, hogy a későbbi detektáláshoz (optikai, elektromos és mágneses) alkalmas jellé alakítsák át. [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 便于 下游 检测 （、 电学 磁学））） 信号 信号 [53, 54 为 下游 （光学 、 电学 磁学 磁学））） 的 转换 便于 下游 （（光学 光学].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. A nukleinsavak kimutatása mikrofluidikus platformokon általában kis mintatérfogatokat (<100 μl) használ, amihez a célnukleinsavakat speciális szondákkal kell amplifikálni, hogy jelekké alakítsák át a későbbi detektáláshoz (optikai, elektromos és mágneses) [53, 54]] .A mikrofluidikában a nukleinsav-amplifikáció felgyorsíthatja a reakciókat, optimalizálhatja a kimutatási határokat, csökkentheti a mintaszükségletet és javíthatja a detektálási pontosságot [55, 56].Az elmúlt években a gyors és pontos detektálás megvalósulásával a mikrofluidikában különböző nukleinsavamplifikációs módszereket alkalmaztak, beleértve a PCR-t és néhány izoterm amplifikációs reakciót.Ez a rész a mikrofluidikus rendszereken alapuló nukleinsav-detektálási módszereket foglalja össze.
A PCR egy szervezet DNS-replikációs folyamatának szimulációja, amelynek elméletét máshol részletesen ismertetjük, és itt nem tárgyaljuk.A PCR nagyon kis mennyiségű cél-DNS/RNS-t képes exponenciális sebességgel amplifikálni, így a PCR hatékony eszköz a nukleinsavak gyors kimutatására.Az elmúlt évtizedekben számos PCR hőciklusos rendszerrel felszerelt hordozható mikrofluidikus eszközt fejlesztettek ki a helyszíni diagnosztika igényeinek kielégítésére [57, 58].Az on-chip PCR négy típusra osztható (hagyományos, folyamatos áramlású, térben kapcsolt és konvektív PCR) a különböző hőmérsékletszabályozási módszerek szerint [59].Például Gee et al.[60] közvetlen reverz transzkripciós kvantitatív PCR (RT-qPCR) módszert fejlesztettek ki saját mikrofluidikus platformjukon a SARS-CoV-2, az influenza A és B vírusok multiplex kimutatására toroktampon mintákban (3a. ábra).Park et al.[61] egy egyszerű kórokozó-elemző chipet épített vékonyfilm PCR, elektródák és egy ujjal működtetett polidimetilsziloxán alapú mikrofluidikus modul integrálásával.Mindazonáltal mindkét munka megtestesíti a hagyományos PCR közös hiányosságait.A PCR-hez hőciklusra van szükség, ami korlátozza az eszköz további miniatürizálását és csökkenti a tesztelési időt.
A folyamatos áramláson alapuló mikrofluidikus és térkapcsolós PCR kifejlesztése kritikus fontosságú e probléma megoldásához.Egy hosszú szerpentin csatorna vagy egy rövid egyenes csatorna használatával a folyamatos áramlású PCR gyors amplifikációt biztosít a reagensek aktív keringtetésével három előmelegítő zónában egy chipen kívüli szivattyúval.Ez a művelet sikeresen elkerüli a különböző reakcióhőmérsékletek közötti átmeneti fázist, és így jelentősen csökkenti a tesztelési időt [62] (3b. ábra).Jung és munkatársai egy másik tanulmányában.[63] egy új rotációs PCR genetikai analizátort javasolt, amely egyesíti a fix és az áramlási PCR jellemzőit ultragyors és multiplex reverz transzkripciós PCR-hez (3c. ábra).A nukleinsav-amplifikációhoz a PCR mikrochipet három különböző hőmérsékletű fűtőblokkon keresztül forgatják: 1. Denaturációs blokk 94 °C-on, 2. Légzőblokk 58 °C-on, 3. Expanziós blokk 72 °C-on.
A PCR alkalmazása mikrofluidikában.A dirRT-qPCR sematikus ábrázolása mikrofluidikus platformon (adaptált [60]-ból).b Folyamatos áramlású PCR microarray sematikus ábrázolása egy szerpentin csatornán (adaptált a [62]-ből).c Egy forgó PCR genetikai analizátor sematikus ábrázolása, amely mikrochipből, három fűtőblokkból és léptetőmotorból áll (adaptált a [63]-ból).d A termokonvekciós PCR diagramja centrifugálással és beállítással (adaptált a [64]-ből).DirRT-qPCR, közvetlen kvantitatív reverz transzkripciós polimeráz láncreakció
A kapillárisok és hurkok vagy akár vékony lemezek használatával a konvekciós PCR gyorsan amplifikálja a nukleinsavakat természetes szabad termikus konvekcióval anélkül, hogy külső szivattyúra lenne szükség.Például egy ciklikus olefin polimer mikrofluidikus platformot fejlesztettek ki egy gyártott forgó fűtőfokozaton, amely termikus ciklust használ centrifugálással egy PCR hurok mikrocsatornában [64] (3d. ábra).A reakcióoldatot termikus konvekció hajtja, amely folyamatosan cseréli a magas és alacsony hőmérsékletet egy gyűrűs szerkezetű mikrocsatornában.A teljes amplifikációs folyamat 10 perc alatt befejezhető 70,5 pg/csatorna kimutatási határ mellett.
Ahogy az várható volt, a rapid PCR hatékony eszköz a teljesen integrált minta-válasz molekuláris diagnosztikai és multiplex elemző rendszerek számára.A gyors PCR jelentősen csökkenti a SARS-CoV-2 kimutatásához szükséges időt, ami hozzájárul a COVID-19 világjárvány hatékony leküzdéséhez.
A PCR-hez összetett hőciklusra van szükség, amely nem alkalmas POCT-re.Újabban izoterm amplifikációs technikákat alkalmaznak a mikrofluidikára, beleértve, de nem kizárólagosan a LAMP-t, a rekombináz polimeráz amplifikációt (RPA) és a nukleinsavszekvenciákon alapuló amplifikációt [65, 66, 67, 68].Ezekkel a technikákkal a nukleinsavakat állandó hőmérsékleten amplifikálják, ami megkönnyíti az olcsó, rendkívül érzékeny hordozható POCT-eszközök létrehozását molekuláris diagnosztikához.
A nagy áteresztőképességű mikrofluidikai alapú LAMP-vizsgálatok lehetővé teszik a fertőző betegségek többszöri kimutatását [42, 69, 70, 71].A centrifugális mikrofluidikus rendszerrel kombinálva a LAMP tovább segítheti a nukleinsav-detektálás automatizálását [69, 72, 73, 74, 75].A spin-and-react SlipChip-et több párhuzamos baktérium vizuális kimutatására fejlesztették ki LAMP segítségével [76] (4a. ábra).Optimalizált LAMP használatakor a fluoreszcencia jel-zaj arány körülbelül 5-szöröse volt, és a kimutatási határ elérte a 7,2 kópia/μl genomiális DNS-t. Ezen túlmenően öt gyakori emésztőszervi bakteriális kórokozó, köztük a Bacillus cereus, az Escherichia coli, a Salmonella enterica, a Vibrio fluvialis és a Vibrio parahaemolyticus létezését vizualizáltuk a módszer alapján < 60 perc alatt. Ezen túlmenően öt gyakori emésztőszervi bakteriális kórokozó, köztük a Bacillus cereus, az Escherichia coli, a Salmonella enterica, a Vibrio fluvialis és a Vibrio parahaemolyticus létezését vizualizáltuk a módszer alapján < 60 perc alatt.Ezen túlmenően az emésztőrendszer öt gyakori bakteriális kórokozója, köztük a Bacillus cereus, az Escherichia coli, a Salmonella enterica, a Vibrio fluvialis és a Vibrio parahaemolyticus jelenléte kevesebb mint 60 perc alatt láthatóvá vált ezzel a módszerrel.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 常见 消化道 细菌病 原体 的 ， ， 蜡状 芽孢杆菌 、 大 、 肠 沙门 氏 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌 弧菌。。。 芽孢杆菌 芽孢杆菌 、 、 大 大 大 肠杆菌 肠杆菌 肠杆菌 肠杆菌 肠杆菌 大 大 大 大 大 大 大此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 消化道 细菌病 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 大 大 肠杆菌 肠杆菌 肠杆菌 、 、 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠 肠弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPEzenkívül öt gyakori bakteriális gasztrointesztinális kórokozó, köztük a Bacillus cereus, az Escherichia coli, a Salmonella enterica, a Vibrio fluvius és a Vibrio parahaemolyticus jelenlétét kevesebb mint 60 perc alatt láthatóvá tettük ezzel a módszerrel.
A LAMP előnyei a mikrofluidikában többek között a gyors reagálás és a miniatürizált detektálás.A reakcióhőmérséklet miatt (körülbelül 70 °C) azonban a LAMP során elkerülhetetlenül aeroszolok keletkeznek, ami nagy hamis pozitív arányt eredményez.A vizsgálat specifitását, a primer tervezését és a hőmérséklet-szabályozást szintén optimalizálni kell a LAMP-hoz.Ezen túlmenően a több célpont felismerését egyetlen chipen megvalósító chiptervek nagy értéket képviselnek, ezért fejlesztendők.Emellett a LAMP egy chipbe integrált többcélú érzékelésre is alkalmas, aminek nagy jelentősége van, de még bőven van hova fejlődni.
A LAMP magas hamis pozitív aránya részben csökkenthető RPA-val, mivel a viszonylag alacsony reakcióhőmérséklet (~37 °C) viszonylag kevés párolgási problémát eredményez [77].Az RPA rendszerben két ellentétes láncindító indítja el a DNS szintézist egy rekombinázhoz kötődve, és az amplifikáció 10 percen belül befejeződik [78, 79, 80, 81].Ezért az egész RPA folyamat sokkal gyorsabb, mint a PCR vagy a LAMP.Az elmúlt években kimutatták, hogy a mikrofluidikus technológia tovább javítja az RPA sebességét és pontosságát [82,83,84].Például Liu et al.[85] kifejlesztett egy mikrofluidikus integrált laterális áramlású polimeráz rekombináz amplifikációs vizsgálatot a SARS-CoV-2 gyors és érzékeny kimutatására a reverz transzkripciós RPA (RT-RPA) és egy univerzális laterális áramlású tesztcsík detektáló rendszer integrálásával.egyetlen mikrofluidikus rendszerbe.4b. ábra).Az észlelési határ 1 kópia/µl vagy 30 kópia/minta, és a detektálás körülbelül 30 perc alatt befejezhető.Kong et al.hordható mikrofluidikus eszközt fejlesztettek ki.[86] testhőmérsékletet és mobiltelefon-alapú fluoreszcens detektáló rendszert használt a HIV-1 DNS gyors és közvetlen kimutatására RPA segítségével (4c. ábra).A hordható RPA-teszt 24 percen belül 100 kópiát/ml-t észlel a célszekvenciából, ami nagyszerű lehetőséget mutat a HIV-1-fertőzött csecsemők gyors diagnosztizálására korlátozott erőforrások mellett.
Izotermikus amplifikáció a gondozási helyszíni vizsgálatban (POCT).Centrifugálás és reakció SlipChip fejlesztése és gyártása.A plazmahegesztés után a felső és alsó forgácsot egy anyakészlettel összeszerelték, hogy kialakítsák a végső forgácsot (a [76]-ból adaptálva).b A COVID-19 észlelésére szolgáló MI-IF-RPA rendszer vázlata (adaptált a [85]-ből).c Egy viselhető RPA teszt vázlata a HIV-1 DNS gyors kimutatására (adaptált a [86]-ból).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboxifluoreszcein, humán immundeficiencia vírus HIV, RPA rekombináz polimeráz amplifikáció, LED fénykibocsátó dióda, MI-IF-regenerált La Microfluidics Flowterase Pomerase La Microfluidics Erősítés
A mikrofluidikus alapú RPA gyorsan fejlődik, azonban a chipgyártás költsége és a reakciók fogyasztása túl magas, ezért csökkenteni kell a technológia elérhetőségének növelése érdekében.Ezenkívül az RPA nagy érzékenysége befolyásolhatja a nem specifikus termékek amplifikációját, különösen szennyeződés jelenlétében.Ezek a korlátozások befolyásolhatják az RPA alkalmazását a mikrofluidikus rendszerekben, és további optimalizálást igényelnek.A különböző célpontokhoz jól megtervezett primerekre és szondákra is szükség van az RPA-alapú mikrofluidikai stratégiák megvalósíthatóságának javításához a POCT-ban.
A Cas13 és a Cas12a képes véletlenszerűen hasítani a nukleinsavakat, így kimutatási és diagnosztikai eszközként fejleszthetők.A Cas13 és a Cas12a a cél DNS-hez vagy RNS-hez való kötődéskor aktiválódik.Az aktiválás után a fehérje elkezdi hasítani a többi közeli nukleinsavat, ami után a kórokozó-specifikus nukleinsavakat megcélzó irányító RNS-ek le tudják hasítani a kioltott fluoreszcens próbákat, és fluoreszcenciát szabadítanak fel.Ezen elmélet alapján Kellner et al.[87] kifejlesztett egy Cas13-alapú módszert [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], és Broughton et al.[88] egy másik, Cas12a-n alapuló megközelítést dolgozott ki [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
Az elmúlt években különböző módszerek jelentek meg a nukleinsavak kimutatására CRISPR alapú [89, 90].A hagyományos CRISPR-alapú módszerek gyakran idő- és munkaigényesek a többféle eljárás miatt, beleértve a nukleinsav extrakciót, amplifikációt és CRISPR kimutatást.A folyadékok levegővel való érintkezése növelheti a hamis pozitív eredmények esélyét.A fentiek alapján a CRISPR-alapú rendszereknek nagy szükségük van optimalizálásra.
A CRISPR-Cas12a és CRISPR-Cas13a észlelési alkalmazásokhoz pneumatikusan vezérelt mikrofluidikus platformot fejlesztettek ki, amely 24 elemzést tud párhuzamosan elvégezni [91].A rendszer fel van szerelve egy fluoreszcencia-detektáló eszközzel, amely megkerüli a nukleinsav-amplifikációt, és automatikusan észleli a femtomoláris DNS- és RNS-mintákat.Chen et al.[92] integrált rekombináz amplifikáció a CRISPR-Cas12a rendszerrel centrifugális mikrofluidikában (5a. ábra).Ez a munka áthidalja e két folyamat integrálásának nehézségeit, mivel a Cas12a képes megemészteni a hírvivő DNS-t és gátolni az amplifikációs folyamatot.Ezenkívül Chen és mtsai.[92] emellett előre tárolta a reakcióreagenseket egy centrifugális mikrofluidikus vezérlőben, hogy automatikusan befejezze a teljes folyamatot.Egy másik munkában Silva et al.[93] kifejlesztett egy CRISPR/Cas12a erősítés nélküli diagnosztikai módszert és egy okostelefont a SARS-CoV-2 kimutatására (5b. ábra).Ez a mobiltelefon-alapú amplifikációmentes rendszerként ismert vizsgálat egy CRISPR/Cas-függő enzimet tartalmaz, amely a mikrofluidikus csatornákban kataláz által generált buborékjelek okostelefonos megjelenítésén alapul.Kevesebb, mint 50 kópia/µl nukleinsav érzékeny detektálása előamplifikáció nélkül, a teljes folyamat a mintainjektálástól a jelleolvasásig mindössze 71 percet vesz igénybe.
CRISPR-en alapuló nukleinsav kimutatási módszerek.Centrifugális POCT a CRISPR alapú integrált molekuláris diagnosztikához (adaptált a [92]-ből).b CASCADE teszt fejlesztése a SARS-CoV-2 okostelefon-alapú elemzéséhez (adaptált a [93]-ból).RAA rekombináz amplifikáció, PAM szomszédos protospacer motívum, CRISPR klaszterezett rövid palindrom ismétlődések rendszeres időközönként, CASCADE rendszer mobiltelefon amplifikáció nélkül CRISPR/CAS-függő enzimekkel, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid-hidroklorid EDC
A nukleinsav-detektálás utolsó lépéseként a jeldetektálás közvetlenül tükrözi a diagnosztikai eredményeket, és kritikus tényező a hatékony, érzékeny és pontos POCT kifejlesztésében.A jelek leolvashatók különféle módszerekkel, például fluoreszcens, elektrokémiai, kolorimetriás és mágneses stratégiákkal.Ebben a részben ismertetjük az egyes megközelítések indokait, és összehasonlítjuk a fertőző betegségek molekuláris diagnosztikáját mikrofluidikában.
A fluoreszcencia alapú stratégiákat széles körben alkalmazzák a fertőző betegségek POCT-diagnosztikájában a kiváló érzékenység, az alacsony költség, a könnyű kezelhetőség és az ellátási pontok elemzése miatt [94, 95].Ezek a stratégiák jelölt fluoroforokat, például fluoreszcens festékeket és nanoanyagokat használnak kimutatható jel létrehozására (fluoreszcencia fokozása vagy kioltása).Ez az eredmény azt sugallja, hogy a fluoreszcencia alapú stratégiák feloszthatók közvetlen fluoreszcens jelölésre, jel-on és jel-off fluoreszcens detektálásra [96].A közvetlen fluoreszcens jelölés kimutatása speciális fluoreszcens címkéket használ a specifikus ligandumok megjelölésére, amelyek meghatározott mennyiségű fluoreszcenciát generálnak, amikor szelektíven kötődnek egy célponthoz.A jel alapú fluoreszcencia detektálásnál a fluoreszcens jel minősége pozitív összefüggésben van a vizsgált nagyságrenddel.A fluoreszcencia intenzitása elhanyagolható célpont hiányában, és akkor észlelhető, ha elegendő mennyiségű célpont van jelen.Ezzel szemben a „jel-kikapcsolt” fluoreszcencia által detektált fluoreszcencia intenzitása fordítottan arányos a célpont mennyiségével, kezdetben eléri a maximális értéket, majd fokozatosan csökken, ahogy a célpont megnagyobbodik.Például a CRISPR-Cas13a célfüggő transz-hasítási mechanizmust használva Tian et al.[97] új felismerési stratégiát dolgozott ki a reverz transzkripciót közvetlenül megkerülő RNS-ek kimutatására (6a. ábra).A komplementer cél-RNS-ekhez való kötődés után a CRISPR-Cas13-RNS komplex aktiválható, ami transzkollaterális hasítást vált ki a nem specifikus riporter-RNS-ekkel.A fluoreszcensen jelölt riportert [fluorofor (F)] a kvencser (Q) érintetlenül leállítja, és fluoreszkál, amikor az aktivált komplex elhasítja.
Az elektrokémiai detektálás előnye a nagy érzékelési sebesség, az egyszerű gyártás, az alacsony költség, a könnyen szállítható és az automatikus vezérlés.Ez egy hatékony analitikai módszer POCT alkalmazásokhoz.Grafén térhatású tranzisztorok alapján Gao et al.[98] nanobioszenzort fejlesztettek ki Borrelia burgdorferi baktériumból származó Lyme-kór antigének multiplex kimutatására, 2 pg/ml kimutatási határral (6b. ábra).
A kolorimetriás vizsgálatokat POCT-alkalmazásokban alkalmazták, kihasználva a hordozhatóság, az alacsony költség, az egyszerű előkészítés és a vizuális leolvasás előnyeit.A kolorimetriás detektálás felhasználhatja a peroxidáz vagy peroxidáz-szerű nanoanyagok oxidációját, a nanoanyagok aggregációját és indikátorfestékek hozzáadását, hogy a célnukleinsavak jelenlétéről szóló információkat látható színváltozásokká alakítsák [99, 100, 101].Nevezetesen, hogy az arany nanorészecskéket széles körben használják a kolorimetriás stratégiák kidolgozásában, és gyors és jelentős színváltozást kiváltó képességük miatt egyre nagyobb az érdeklődés a fertőző betegségek in situ diagnosztizálására alkalmas POCT kolorimetriás platformok kifejlesztése iránt [102].Egy integrált centrifugális mikrofluidikus eszközzel [103] a szennyezett tejmintákban 10 baktériumsejt szintjén automatikusan kimutathatók az élelmiszer eredetű kórokozók, és az eredmények 65 percen belül vizuálisan leolvashatók (6c. ábra).
A mágneses érzékelési technikák mágneses anyagok segítségével pontosan képesek kimutatni az analitokat, és az elmúlt évtizedekben jelentős érdeklődés mutatkozott a POCT alkalmazások iránt.A mágneses érzékelési technikáknak van néhány egyedi előnye, mint például az olcsó mágneses anyagok a drága optikai alkatrészek helyett.A mágneses tér használata azonban javítja a detektálás hatékonyságát és csökkenti a minta-előkészítési időt [104].Emellett a mágneses szondázás eredményei nagy specificitást, érzékenységet és magas jel-zaj viszonyt mutatnak a biológiai minták jelentéktelen mágneses háttérjelének köszönhetően [105].Sharma és mtsai.mágneses alagútcsatlakozáson alapuló bioszenzort integrált egy hordozható mikrochip platformba.[106] a kórokozók multiplex kimutatására (6d. ábra).A bioszenzorok érzékenyen detektálják a kórokozókból izolált szubnanomoláris nukleinsavakat.
Tipikus jelérzékelési módszer.A Cas13a hiperlokalizált kimutatásának koncepciója (adaptált a [97]-ből).b Grafén nanobioszenzor FET Lyme GroES scFv-vel kombinálva (adaptált [98]).c Kolorimetriás indikációk élelmiszer eredetű kórokozók multiplex kimutatására centrifugális mikrofluidikus chipben: 1. és 3. számú minták célkórokozókkal, valamint 2., 4. és 5. számú minták célkórokozók nélkül (adaptált a [103]-ból) .d Mágneses alagút csomóponton alapuló bioszenzor, amely magában foglal egy platformot, egy beépített blokkoló erősítőt, egy vezérlőegységet és egy tápegységet a jelek előállításához/gyűjtéséhez (adaptált a [106]-ból).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikon, PMMA polimetil-metakrilát
A fenti kimutatási módszerek kiváló tulajdonságai ellenére még mindig vannak hátrányai.Ezeket a módszereket összehasonlítjuk (1. táblázat), beleértve néhány alkalmazást részletekkel (előnyök és hátrányok).
A mikrofluidika, a mikroelektromechanikai rendszerek, a nanotechnológia és az anyagtudomány fejlődésével folyamatosan fejlődik a mikrofluidikus chipek alkalmazása a fertőző betegségek kimutatására [55,96,107,108].A miniatűr berendezések és folyadékok precíz kezelése hozzájárul a diagnosztikai pontossághoz és a költséghatékonysághoz.Ezért a további fejlesztés érdekében erőfeszítéseket tettek a chipek optimalizálására és frissítésére, aminek eredményeként különböző szerkezetű és funkciójú mikrofluidikus chipek születtek.Itt röviden bemutatunk néhány elterjedt mikrofluidikus platformtípust, és összehasonlítjuk jellemzőiket (előnyök és hátrányok).Ezenkívül az alább felsorolt ​​példák többsége elsősorban a SARS-CoV-2 elleni küzdelemre összpontosít.
A LOCC-k a legelterjedtebb miniatürizált komplex analitikai rendszerek, működésük nagymértékben miniatürizált, integrált, automatizált és párhuzamosított a mintainjektálástól és -előkészítéstől, az áramlásszabályozástól és a folyadékdetektálástól kezdve [109, 110].A folyadékokat gondosan megtervezett geometria és számos fizikai hatás, például nyomásgradiens, kapilláris hatás, elektrodinamika, mágneses mezők és akusztikus hullámok kölcsönhatása révén manipulálják [111].A LOCC kiváló előnyöket mutat a nagy áteresztőképességű szűrésben és a többszörös észlelésben, gyors elemzési sebességgel, kis mintamérettel, alacsony energiafogyasztással, valamint magas kezelési és működési hatékonysággal;azonban a LOCC eszközök nagyon kényesek, és a gyártás, a csomagolás és az interfész.A multiplexelés és az újrafelhasználás azonban óriási nehézségekkel néz szembe [96].Más platformokhoz képest a LOCC egyedülálló előnyökkel rendelkezik a maximális alkalmazások sokfélesége és a legjobb technológiai kompatibilitás tekintetében, de nyilvánvalóak a hátrányai is, nevezetesen a nagy bonyolultság és a rossz ismételhetőség.A külső szivattyúktól való függés, amelyek gyakran terjedelmesek és drágák, tovább korlátozza alkalmazásukat a POCT-ben.
A COVID-19 járvány idején a LOCC nagy figyelmet kapott.Ugyanakkor számos új chip van, amelyek több technológiát ötvöznek.Például az okostelefonokat manapság széles körben használják hordozható elemző eszközökként, és nagy lehetőségek rejlenek a LOCC integrációban.Sun et al.[21] egy mikrofluidikus chipet állított elő, amely lehetővé teszi öt kórokozó, köztük a SARS-CoV-2 specifikus nukleinsavszekvenciájának multiplexelését LAMP segítségével, és a reakció befejeződése után 1 órán belül okostelefonnal elemezte azokat.Egy másik példaként Sundah et al.[112] létrehoztak egy molekuláris kapcsolót [katalitikus amplifikáció molekuláris átmeneti állapot kapcsolóval (CATCH)] a SARS-CoV-2 RNS-célpontok okostelefonok segítségével történő közvetlen és érzékeny kimutatására. A CATCH kompatibilis a hordozható LOCC-vel, és kiváló teljesítményt ér el (körülbelül 8 RNS-másolat/μl; < 1 óra szobahőmérsékleten) [112]. A CATCH kompatibilis a hordozható LOCC-vel, és kiváló teljesítményt ér el (körülbelül 8 RNS-másolat/μl; < 1 óra szobahőmérsékleten) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копна 2. 1. 1. 1. A CATCH kompatibilis a hordozható LOCC-vel, és kiváló áteresztőképességet biztosít (körülbelül 8 RNS-másolat/µl; < 1 óra szobahőmérsékleten) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкри; трай 1 копий РНК/мкри); A CATCH kompatibilis a hordozható LOCC-kkel, és kiváló teljesítményt nyújt (körülbelül 8 RNS-másolat/µl; < 1 óra szobahőmérsékleten) [112].Ezenkívül a molekuláris diagnosztikához használt LOCC eszközök bizonyos hajtóerőket is használnak, mint például a vákuum, a nyújtás és az elektromos mező.Kang és mtsai.[113] valós idejű, ultragyors nanoplazma-chipen PCR-t mutatott be a COVID-19 gyors és kvantitatív diagnosztizálására terepen, vákuumplazmonos folyékony PCR chip segítségével.Li és mtsai.[114] ezt követően kifejlesztett egy nyújtással hajtott mikrofluidikus chipet, amely lehetővé tette a COVID-19 diagnosztizálását.A platform az RT-LAMP erősítőrendszert használja annak meghatározására, hogy a minta minőségileg pozitív vagy negatív.Ezt követően Ramachandran et al.[115] a mikrofluidikában alkalmazott szelektív ionfókuszálási technika, az izotachoforézis (ITP) segítségével érte el a megfelelő elektromos tér gradienseket.Az ITP segítségével a nyers nasopharyngealis tamponmintákból származó cél RNS automatikusan tisztítható.Aztán Ramachandran et al.[115] Ennek az ITP-tisztításnak az ITP-vel továbbfejlesztett LAMP- és CRISPR-tesztekkel való kombinálása körülbelül 35 perc alatt kimutatta a SARS-CoV-2-t humán nasopharyngealis tamponban és klinikai mintákban.Emellett folyamatosan születnek új ötletek.Jadhav et al.[116] egy olyan diagnosztikai sémát javasolt, amely a felülettel javított Raman-spektroszkópián alapul, egy mikrofluidikus eszközzel kombinálva, amely függőlegesen orientált arany/ezüst bevonatú szén nanocsöveket vagy eldobható elektrofonású mikro/nanocsöveket tartalmaz.A membránfunkciós beépített szűrőmikrocsatornák eldobhatóak.Az eszköz adszorbeálja a vírusokat különböző testnedvekből/kiválásokból, például nyálból, orrgaratból és könnyekből.Így a vírustiter bőséges, és a vírus pontosan azonosítható a Raman aláírással.
A LOAD egy centrifugális mikrofluidikus platform, amelyben minden folyamatot egy frekvenciaprotokoll vezérel, amely egy mikrostrukturált hordozót forgat [110].A LOAD készüléket a centrifugális erő, mint fontos hajtóerő alkalmazása jellemzi.A folyadékok kapilláris, Euler és Coriolis erőknek is ki vannak téve.Egy centrifugakészülék segítségével az elemzéseket folyamatos folyadéküzemben végzik a radiális befelé iránytól a kifelé irányuló helyzetig, így nincs szükség további külső csövekre, szivattyúkra, működtetőkre és aktív szelepekre.Röviden, egyetlen vezérlési módszer leegyszerűsíti a működést.Ugyanabban a mikrofluidikus csatornában, a terhelés középpontjától azonos távolságra lévő folyadékra ható erők egyenlőek, ami lehetővé teszi a csatorna szerkezetének megismétlését.Így a LOAD berendezés tervezése és gyártása egyszerűbb és gazdaságosabb, mint a hagyományos LOCC berendezések, miközben a reakciók nagyrészt függetlenek és párhuzamosak;azonban a centrifugális berendezések nagy mechanikai szilárdsága miatt a rendelkezésre álló forgácsanyag korlátozott, és a kis mennyiségek nehézkesek.az autóhoz.Ugyanakkor a legtöbb LOAD eszközt csak egyszeri használatra tervezték, ami nagy léptékű detektálás esetén drága [96, 117, 118, 119].
Az elmúlt évtizedekben az egyik legígéretesebb mikrofluidikus eszköznek tartott LOAD jelentős figyelmet kapott a kutatók és a gyártók részéről.Így a LOAD széles körben elfogadottá vált, és fertőző kórokozók molekuláris diagnosztikájában alkalmazták [120, 121, 122, 123, 124], különösen a COVID-19 járvány idején.Például 2020 végén Ji et al.[60] közvetlen RT-qPCR vizsgálatot mutatott be a SARS-CoV-2 és az influenza A és B fertőzések gyors és automatizált párhuzamos kimutatására toroktampon mintákból.Aztán Xiong et al.[74] bemutatott egy LAMP-ba integrált discoid mikrofluidikus platformot hét humán légúti koronavírus, köztük a SARS-CoV-2 gyors, pontos és egyidejű kimutatására, 40 percen belül.2021 elején de Oliveira et al.[73] bemutatott egy polisztirol toner centrifugális mikrofluidikus chipet, amelyet kézi működtetésű ujjbegy-forgatóval végeztek a COVID-19 RT-LAMP molekuláris diagnosztizálására.Ezt követően Dignan et al.[39] bemutatott egy automata, hordozható centrifuga mikroeszközt a SARS-CoV-2 RNS tisztítására közvetlenül a szájüregi tamponmetszetekből.Medved et al.[53] egy beépített SARS-CoV-2 aeroszol-mintavevő rendszert javasolt egy kis térfogatú, forgó mikrofluidikus fluoreszcens chippel, 10 kópia/μL kimutatási határral és 15 perces minimális ciklusküszöbkel.Suarez és mtsai.[75] nemrégiben egy integrált moduláris centrifugális mikrofluidikus platform kifejlesztéséről számolt be a SARS-CoV-2 RNS közvetlen kimutatására hővel inaktivált nasopharyngealis tamponmintákban LAMP segítségével.Ezek a példák bemutatják a LOAD nagyszerű előnyeit és ígéretét a COVID-19 molekuláris diagnosztikájában.
1945-ben Muller és Clegg [125] először mutatott be mikrofluidikus csatornákat papíron szűrőpapír és paraffin felhasználásával.2007-ben a Whitesides csoport [126] megalkotta az első funkcionális papírplatformot fehérje- és glükóztesztekhez.A papír a mikrofluidika ideális hordozójává vált.A papír olyan jellemző tulajdonságokkal rendelkezik, mint a hidrofilitás és a porózus szerkezet, a kiváló biokompatibilitás, a könnyű súly, a rugalmasság, a hajtogathatóság, az alacsony költség, a könnyű használat és a kényelem.A klasszikus µPAD-k papírhordozóra épített hidrofil/hidrofób struktúrákból állnak.A háromdimenziós szerkezettől függően a μPAD-ek kétdimenziós (2D) és háromdimenziós (3D) μPAD-ekre oszthatók.A 2D µPAD-ket hidrofób határok kialakításával állítják elő mikrofluidikus csatornák kialakítása céljából, míg a 3D µPAD-ket általában 2D mikrofluidikus papírrétegekből állítják elő, néha papírhajtogatással, csúsztatási technikákkal, nyitott csatornákkal és 3D nyomtatással [96].A μPAD-n lévő vizes vagy biológiai folyadékokat elsősorban kapilláriserő szabályozza külső áramforrás nélkül, megkönnyítve a reagensek előzetes tárolását, a mintakezelést és a multiplex detektálást.A pontos áramlásszabályozást és a multiplex detektálást azonban gátolja az elégtelen detektálási sebesség, érzékenység és újrafelhasználhatóság [96, 127, 128, 129, 130].
Szokatlan mikrofluidikus platformként a μPAD-t széles körben népszerűsítették és fejlesztették olyan fertőző betegségek molekuláris diagnosztizálására, mint a HCV, HIV és SARS-CoV-2 [131, 132].A HCV szelektív és érzékeny kimutatására Tengam et al.[133] egy új, fluoreszcens papíron alapuló bioszenzort fejlesztettek ki egy nagyon specifikus, pirrolidinil-peptid alapú nukleinsav próbával.A nukleinsavakat kovalensen rögzítik a részlegesen oxidált cellulózpapíron aminocsoportok és aldehidcsoportok közötti reduktív alkilezéssel, a kimutatás pedig fluoreszcencián alapul.Ezeket a jeleket egy speciálisan készített kütyü le tudja olvasni, hordozható fluoreszkáló kamerával és mobiltelefon kamerájával kombinálva.Ezt követően Lu et al.[134] papíralapú, nikkel/arany nanorészecskék/szén nanocsövek/polivinil-alkohol organofém váz-kompozit alapú flexibilis elektródát terveztek HIV-célpontok kimutatására DNS-hibridizációval, DNS-redox indikátorként metilénkéket használva.Újabban Chowdury et al.[135] hipotetikus platformtervet mutatott be a µPAD-tesztelés pont-of-care µPAD-tesztjéhez, amelyben a beteg nyers nyálát LAMP-val és hordozható képalkotó technológiával kombinálják a COVID-19 analit kimutatására.
Az oldalirányú áramlási tesztek kapilláris erők segítségével irányítják a folyadékokat, és szabályozzák a folyadék mozgását a porózus vagy mikrostrukturált hordozók nedvesíthetősége és jellemzői alapján.Az oldalsó áramlású eszközök mintából, konjugátumból, inkubátorból és detektálóból, valamint abszorbens betétekből állnak.Az LFA-ban lévő nukleinsavmolekulák felismerik a specifikus kötőanyagokat, amelyek előre tárolva vannak a kötőhelyen, és komplexekként kötődnek.Ahogy a folyadék áthalad az inkubációs és detektáló lemezeken, a komplexeket a teszt- és kontrollvonalakon elhelyezkedő befogómolekulák felfogják, szabad szemmel közvetlenül leolvasható eredményeket mutatva.Az LFA jellemzően 2-15 perc alatt teljesíthető, ami gyorsabb, mint a hagyományos felfedezés.A speciális mechanizmusnak köszönhetően az LFA kevés műveletet igényel, és nem igényel további felszerelést, ami nagyon felhasználóbaráttá teszi.Könnyen gyártható és miniatürizálható, a papíralapú hordozók költsége alacsonyabb.Azonban csak kvalitatív elemzésre használják, és a kvantitatív kimutatás nagyon nehéz, a multiplexelési képesség és az áteresztőképesség pedig nagyon korlátozott, és egyszerre csak egy elegendő nukleinsav detektálható [96,110,127].
Bár az LFA legtöbb alkalmazása az immunoassay-re összpontosít, az LFA alkalmazása a mikrofluidikus chipek molekuláris diagnosztikájában szintén hatékony és népszerű [136].A hepatitis B vírus esetében a HIV és a SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] egy felfelé konverziós nanorészecskés LFA platformot javasolt, és bemutatta ennek a miniatürizált és hordozható platformnak a sokoldalúságát több célpont érzékeny és kvantitatív kimutatásával, mint például a HBV nukleinsav.Ezenkívül Fu és mtsai.[138] egy új LFA-t mutatott be, amely a felülettel javított Raman-spektroszkópián alapul a HIV-1 DNS kvantitatív elemzéséhez alacsony koncentrációkban.A SARS-CoV-2 gyors és érzékeny kimutatására Liu et al.[85] kifejlesztett egy mikrofluidikusan integrált RPA oldalirányú áramlási analízist az RT-RPA és az univerzális laterális áramlásérzékelő rendszer egyetlen mikrofluidikus rendszerben történő kombinálásával.
A különféle mikrofluidikus platformok alkalmazása az egyes vizsgálatoktól függően változik, teljes mértékben kihasználva a platformok képességeit és előnyeit.Kedvező árú szelepeivel, szivattyúival és csatornáival a LOCC a legátfogóbb platform az alkalmazások sokféleségéhez és az interoperabilitáshoz, a legnagyobb fejlesztési lehetőséggel.Ezért reméljük és javasoljuk, hogy első próbálkozásként a LOCC-nál végezzék el a legújabb vizsgálatokat, és optimalizálják a feltételeket.Emellett várhatóan hatékonyabb és pontosabb módszereket fedeznek fel és alkalmaznak a rendszerben.A LOAD kitűnik a meglévő LOCC-eszközökből származó folyadékok precíz szabályozásában, és egyedülálló előnyöket mutat az egyedi hajtások centrifugális erővel történő kezelésében anélkül, hogy külső meghajtókra lenne szükség, miközben a párhuzamos válaszok elkülöníthetők és szinkronizálhatók.Így a jövőben a LOAD lesz a fő mikrofluidikus platform, kevesebb kézi művelettel és kiforrottabb és automatizáltabb technológiákkal.A µPAD platform egyesíti a LOCC és a papíralapú anyagok előnyeit az alacsony költségű, egyszer használatos diagnosztika érdekében.Ezért a jövőbeni fejlesztésnek a kényelmes és jól bevált technológiákra kell összpontosítania.Ezen túlmenően, az LFA kiválóan alkalmas szabad szemmel történő észlelésre, ami azt ígéri, hogy csökkenti a mintafogyasztást és felgyorsítja az észlelést.A platformok részletes összehasonlítása a 2. táblázatban látható.
A digitális elemzések a mintát sok mikroreaktorra osztják, amelyek mindegyike diszkrét számú célmolekulát tartalmaz [139, 140].A digitális vizsgálatok jelentős előnyöket kínálnak az abszolút mennyiségi meghatározás elvégzésében, mivel párhuzamosan több ezer biokémiai kísérletet hajtanak végre egyidejűleg és külön-külön mikron léptékű kompartmentekben, nem pedig folyamatos fázisban.A hagyományos mikrofluidikához képest a kompartment reakciók csökkenthetik a minta térfogatát, növelhetik a reakció hatékonyságát, és könnyen integrálhatók más analitikai módszerekkel anélkül, hogy csatornákra, szivattyúkra, szelepekre és kompakt kialakításokra lenne szükség [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].A következő két módszert használják digitális vizsgálatokban az oldatok egyenletes és pontos elválasztásának eléréséhez, beleértve a reagenseket és mintákat, például sejteket, nukleinsavakat és egyéb részecskéket vagy molekulákat: (1) cseppemulziók, amelyek kihasználják a folyadék határfelületének instabilitását;(2) A tömbosztást az eszköz geometriai kényszerei hajtják végre.Az első módszernél a mikrocsatornákban reagenseket és mintákat tartalmazó cseppek előállíthatók passzív módszerekkel, mint például ko-áram, keresztáramlás, áramlási fókuszálás, fokozatos emulgeálás, mikrocsatornás emulgeálás, valamint membránok viszkózus nyíróerők révén és emulgeálás csatornaváltással.lokalizációval [143, 145, 146, 148, 149] vagy aktív módszerek alkalmazásával [150, 151], amelyek elektromos, mágneses, termikus és mechanikai szabályozáson keresztül további energiát visznek be.Az utóbbi megközelítésben a mikrofluidikus kamrák legjobb folyadéktérfogat-egyenletességét az azonos méretű térszerkezetek, például mikrogödrök és felületi tömbök megtartásával osztják meg [152,153,154].Nevezetesen, a cseppek olyan fő áramlási szakaszok, amelyek digitális mikrofluidikai (DMF) elektródasorokon is előállíthatók és manipulálhatók.A dielektrikumok elektromos nedvesítése az egyik legjobban tanulmányozott DMF-elmélet, mivel a dielektrikumok elektromos nedvesítése lehetővé teszi az egyes cseppek precíz manipulálását, szabályozva a folyadék alakját és a különböző oldalakon áthaladó aszimmetrikus elektromos jeleket [141, 144].A DMF-ben a cseppekkel végzett fő műveletek közé tartozik a válogatás, felosztás és egyesítés [151, 155, 156], amelyek az elemzés különböző területein, különösen a molekuláris detektálásban alkalmazhatók [157, 158, 159].
A digitális nukleinsavdetektálás egy harmadik generációs molekuláris diagnosztikai technológia, amely a hagyományos PCR-t és a kvantitatív valós idejű PCR-t (qPCR) követi, párhuzamosan nagy áteresztőképességű szekvenálással és folyadékbiopsziával.Az elmúlt két évtizedben a digitális nukleinsavak rohamosan fejlődtek a fertőző kórokozók molekuláris diagnosztikájában [160, 161, 162].A digitális nukleinsav-detektálás abszolút mennyiségi meghatározása a minták és a reagensek különálló rekeszekbe való becsomagolásával kezdődik, hogy biztosítsák, hogy minden egyes célszekvencia azonos valószínűséggel kerüljön be az egyes kompartmentekbe.Elméletileg minden szakaszhoz több célszekvencia is hozzárendelhető, vagy lehet, hogy nincs független mikroreakciós rendszer.A fent leírt különféle érzékelési mechanizmusok révén szabad szemmel vagy géppel láthatóvá lehet tenni azokat a mikrobiális célszekvenciákat tartalmazó rekeszeket, amelyek egy bizonyos küszöbérték feletti jeleket generálnak, és pozitívnak jelölhetők, míg a küszöbérték alatti jeleket generáló többi kompartment pozitívnak jelölhető. .negatívak, amelyek az egyes szakaszok jelét logikai értékké teszik.Így a kialakított kompartmentek számának és a reakció utáni pozitív eredmények arányának kiszámításával a vizsgálati minták eredeti példányai a Poisson-eloszlási képlet segítségével összevethetők standard görbe nélkül, amely a rutin kvantitatív elemzésekhez, mint pl. mint qPCR.[163] A hagyományos molekuláris diagnosztikai módszerekkel összehasonlítva a digitális nukleinsavdetektálás magasabb fokú automatizálást, nagyobb elemzési sebességet és érzékenységet, kevesebb reagenst, kevesebb szennyeződést, valamint egyszerűbb tervezést és gyártást tesz lehetővé.Ezen okokból kifolyólag a SARS-CoV-2 kritikus kitörése során jól tanulmányozták a digitális vizsgálatok, különösen a cseppalapú módszerek molekuláris diagnosztikában, az amplifikációs és jelleolvasási technikákat kombinálva.Például Yin és mtsai.[164] kombinálta a cseppecskés digitális és gyors PCR-módszereket az ORF1ab, N és RNáz P gének kimutatására a SARS-CoV-2-ben egy mikrofluidikus chipben.Figyelemre méltó, hogy a rendszer 115 másodpercen belül képes volt azonosítani a pozitív jelet, ami gyorsabb, mint a hagyományos PCR, ami jelzi annak hatékonyságát a gondozási pontok észlelésében (7a. ábra).Dong és mtsai.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] és Alteri et al.[167] emellett cseppecskés digitális PCR-t (ddPCR) is alkalmaz a SARS-CoV-2 kimutatására mikrofluidikus rendszerben, lenyűgöző eredményekkel.Az észlelési arány további javítása érdekében Shen et al.[168] a ddPCR-alapú chip-képalkotást mindössze 15 másodperc alatt érte el képösszefűzési technikák alkalmazása nélkül, felgyorsítva a ddPCR technológia folyamatát a laboratóriumtól az alkalmazásig.Nemcsak termikus amplifikációs módszereket, például PCR-t alkalmaznak, hanem izoterm amplifikációs módszereket is alkalmaznak a reakciókörülmények egyszerűsítésére és a gyors reakcióra.Lu et al.[71] kifejlesztette a cseppelemzéshez a SlipChipet, amely egy lépésben képes nagy sűrűségű, különböző méretű cseppeket generálni, és digitális LAMP segítségével számszerűsíteni a SARS-CoV-2 nukleinsavakat (7b. ábra).Gyorsan fejlődő technológiaként a CRISPR a digitális nukleinsav-detektálásban is fontos szerepet tölthet be kényelmes kolorimetriás képalkotás révén anélkül, hogy további nukleinsavfestésekre lenne szükség.Ackerman et al.kifejlesztett egy kombinatorikus mátrix reakciót a nukleinsavak multiplex értékelésére.[158] 169 emberrel kapcsolatos vírust, köztük a SARS-CoV-2-t mutatott ki CRISPR-Cas13-alapú nukleinsav-detektáló reagenseket tartalmazó cseppekben egy mikroüreges vizsgálatban (7c. ábra).Ezenkívül az izoterm erősítést és a CRISPR technológiát ugyanabban a rendszerben lehet használni a kettő előnyeinek kombinálására.Park et al.[169] CRISPR/Cas12a digitális assay-t fejlesztettek ki egy kereskedelmi mikrofluidikus chipben a kivont és hővel elölt SARS-CoV-2 detektálására egyfokozatú RT-RPA alapján, rövidebb és magasabb jel-háttér érzékeléssel. időarány., szélesebb dinamikatartomány és jobb érzékenység (7d. ábra).E példák néhány leírását a 3. táblázat tartalmazza.
Tipikus digitális platform a nukleinsav kimutatására.a A gyors digitális PCR munkafolyamat négy kulcsfontosságú lépésből áll: minta előkészítés, a reakcióelegy elosztása, amplifikációs folyamat és célszámítás (adaptált a [164]-ből).b SlipChip cseppek elemzésének vázlata nagy sűrűségű cseppképződéshez (adaptált a [71]-ből).c CARMEN-Cas munkafolyamat diagram13 (adaptált a [158]-ból).d A fejlett digitális vírusészlelés áttekintése CRISPR/Cas-val egy potban (adaptált a [169]-ből).W/O víz az olajban, polidimetilsziloxán PDMS, PCR polimeráz láncreakció, DAQ adatgyűjtés, PID arányos integrál származék, CARMEN kombinatorikus mátrix reakció multiplex nukleinsav értékeléshez, SARS-CoV-2, súlyos akut légzőszervi szindróma, koronavírus 2, RT Reverz transzkriptáz rekombináz polimeráz-RPA amplifikációja, S/B jel a háttérben